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分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)2

分類：基礎(chǔ)知識及應(yīng)用發(fā)布時間：2022-07-25 15:52:19 作者: 來源:

實驗五 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

一、實驗原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PoLymerase chain reaction, PCR）是一項體外特異擴增特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，這項技術(shù)是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一次創(chuàng)舉。

PCR通常需要兩個位于待擴增片段兩側(cè)的寡聚核苷酸引物，這些引物分別與待擴增片段的兩條鏈互補并定向，使兩引物之間的區(qū)域得以通過聚合酶而擴增。反應(yīng)過程為首先必須使得待擴增DNA（稱為模板）置于高溫下解鏈成單鏈模板，這一過程叫變性；第二步為分別與待擴增的DNA片段兩條鏈的3’端互補的人工合成的寡聚核苷酸引物（Primer 15-20bp）在低溫條件下分別與模板兩條鏈兩側(cè)互補結(jié)合，這一過程叫退火，第三步是DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下將脫氧核苷酸（dNTP：dATP, dCTP, dTTP dGTP）沿引物5’—3’方向延伸合成新股DNA，這一過程叫延伸。變性—退火—延伸，如此循環(huán)往復(fù)，每一循環(huán)產(chǎn)生的新股DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR產(chǎn)物是以指數(shù)方式即2ⁿ擴增的，經(jīng)過30-35個循環(huán)，目的片段可以擴增到一百萬倍，在一般PCR儀上，完成這樣的反應(yīng)需幾個小時。

PCR原理示意圖

二、實驗方法

1．在冰上，建立如下PCR反應(yīng)體系，在PCR管內(nèi)分別加入：

10×PCR緩沖液 2μL

25mM dNTPS 1.6μL

2．5mM MgCl₂ 1.2μL

Primer 1（10μM） 0.8μL

Primer 2（10μM） 0.8μL

模板DNA（1μg/μL） 1μL

Taq酶（5Μ/μL） 0.2μL

dd H₂O 12.4μL

總體積 20μL

2．將PCR管放入PCR儀中，按如下程序操作。

①94℃預(yù)變性2min (開始時模板DNA變性要適當(dāng)延長)

②94℃變性1 min → 36℃退火1 min → 72℃延伸2 min,共40個循環(huán)

③72℃延伸7 min（最后一次延伸的時間也要適當(dāng)延長）

④4℃貯存。

3．取1—5μL反應(yīng)產(chǎn)物進行當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

三、PCR優(yōu)化

要得到預(yù)期的PCR擴增效果，從中選定最為適用、重復(fù)性最好的條件，要試用不同的反應(yīng)組分和循環(huán)參數(shù)，其中Mg²⁺濃度、dNTP濃度、模板DNA含量和Taq酶含量等因素對實驗結(jié)果都有很大影響，在預(yù)備實驗中，應(yīng)分別進行梯度實驗和交互組合實驗，最終確定優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系。

四、所需儀器、耗材

1．微量移液槍

2．微量移液槍頭

3．PCR管

4．PCR儀

5．離心機

6．離心管

7．玻璃器皿

五、所需試劑

1．隨機引物（Primer）（10μM）

2. dNTP (25mM)

3. 模板DNA（1μg/μL）

4．Taq DNA聚合酶（5Μ/μL）

5. 10×PCR緩沖液

6．TBE

7．加樣緩沖液

8．MgCl₂（25mM）

六、試劑配制

1．瓊脂糖凝膠電泳所需試劑同實驗四一樣。

2．引物的配制：

訂購的引物大多為干粉，附在管壁上，打開時極易散失，所以打開管子前先離心，然后再慢慢打開管蓋，溶解、調(diào)整濃度后，蓋上管蓋，充分上下振蕩5—10分鐘，不用時在-20℃以下保存。

在干粉管上一般都標(biāo)有260nm下的吸光值，并標(biāo)出堿基對數(shù)，例如一個管標(biāo)為5 OD的20 mer oLigo DNA意思為一個20bp, 260nm下吸光值為5 OD的寡聚DNA。

分子量（MV）=（A堿基數(shù)×312）+（C堿基數(shù)×288）+（G堿基數(shù)×328）+（T堿基數(shù)×303）-61

分子量也可以用以下近似方法計算：

一個脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5，則一個引物的分子量=堿基數(shù)×324.5

例如：現(xiàn)有一個引物管標(biāo)為0.2 OD 10 mer如配制引物濃度為10μM,方法如下：

分子量=10×324.5=3245

質(zhì)量數(shù)=0.2×33=6.6μg (1 OD ssDNA=33μg)

摩爾數(shù)=6.6μg/3245=0.002 μmoL=2 nmoL

（2 nmoL/10μM）×1000=200μL

所以應(yīng)加200μL水，此管引物才能調(diào)整為10μM。

七、思考題

1． PCR的反應(yīng)原理是什么？

2． PCR反應(yīng)體系包括那些成分？

實驗六 隨機擴增多態(tài)性DNA反應(yīng)（RAPD）

一、相關(guān)知識

遺傳標(biāo)記（genetic markers）是研究生物遺傳變異規(guī)律及其物質(zhì)基礎(chǔ)的重要手段。其方法主要有4種類型，即形態(tài)標(biāo)記（morphological markers）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological markers）、生化標(biāo)記（biochemecal markers）和分子標(biāo)記（molecular markers）。與前三種標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有以下優(yōu)越性：（1）直接以核酸作為研究對象，在植物體的各個組織、各個發(fā)育時期均可檢測，不受季節(jié)、環(huán)境限制，與發(fā)育時期無關(guān)，可用于植物基因型的早期選擇。（2）標(biāo)記數(shù)量極多，遍及整個基因組。（3）多態(tài)性高，由于自然存在著許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料。（4）由許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性（codominance），能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，可提供完整的遺傳信息。

目前，常用的分子標(biāo)記技術(shù)主要有限制性長度片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）、染色體或基因組原位雜交（genomic in situ hybridization，GISH）、mRNA差別顯示（mRNA differential display，mRNA-DD）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、消減雜交法（subtractive hybridization，SH）、代表性差異分析法（representation difference analysis，RDA）、任意引物PCR（arbitrary-primer PCR，AP-PCR）、DNA擴增指紋（DNA amplified fingerprinting，DAF）、單引物擴增反應(yīng)（single primer amplification reaction，SPAR）、順序表達位點擴增（sequenced characteried amplified region，SCAR）、加錨微衛(wèi)星寡核苷酸（anchored microsatellite oligonucleotide，AMO）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、序列標(biāo)簽位點（sequence-tagged site，STS）等等。

一、實驗原理

RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，它是利用一系列（通常數(shù)百個）不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為十聚體）為引物，模板在92-94℃變性解鏈后，如果雙鏈DNA分子在一定長度內(nèi)具有反向平行又與引物互補的片段，引物的位置是在彼此可擴增的距離內(nèi)（引物間距為200-2000bp），那么不連續(xù)的分子量為200-2000bp的DNA片段就會通過PCR產(chǎn)生。高溫變性、低溫退火、適度延伸，如此往復(fù)循環(huán)，經(jīng)過30～40個循環(huán)，產(chǎn)物即可擴增到百萬倍以上，如此高產(chǎn)的DNA片段經(jīng)電泳分離和EB染色后，直接在紫外觀察和照相。

RAPD技術(shù)簡單、容易掌握，在短期內(nèi)可獲得大量的遺傳標(biāo)記，這些優(yōu)點逐漸被人們接受后，發(fā)展神速，短短三年中在生物學(xué)的諸多領(lǐng)域，如遺傳指紋作圖、檢測遺傳多樣性與穩(wěn)定性（品種鑒定、物種起源與進化）等。

三、實驗方法

（一）DNA的提取

同前CTAB法。

（二）純度檢測及濃度調(diào)整

同實驗四。

（三）操作程序

1．反應(yīng)體系的制備

冰上建立如下反應(yīng)體系，夾取一支PCR管，分別加入下列成分：

10×PCR Buffer 2.0 μl

模板DNA（500ng/μl） 1.0 μl

dNTPs（2.5mM） 1.6 μl

MgCl₂（25mM） 2.0 μl

Primer（20μM） 1.2 μl

Taq酶（2.5U/μl） 0.5 μl

加ddH₂O至總體積 20.0 μl

上下吸打混勻，離心收集。礦物油封蓋。

2．?dāng)U增程序

然后將PCR管放入PCR儀中，按如下程序操作。

94℃，預(yù)變性5min；94℃變性1min，37℃退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

3．瓊脂糖凝膠電泳檢測

方法同實驗三，膠濃度為2%。

四、反應(yīng)的影響因素及注意事項

（一）影響因素

在RAPD反應(yīng)過程中，涉及的反應(yīng)因子很多，且對反應(yīng)條件敏感，任何一個反應(yīng)因子設(shè)置不當(dāng)，都會影響整個反應(yīng)的過程，或者改變帶型。通常情況下，實驗室要系統(tǒng)地探索各反應(yīng)條件及影響因子，優(yōu)化反應(yīng)體系，得到一個實驗條件標(biāo)準(zhǔn)的RAPD反應(yīng)。

反應(yīng)過程中的影響因子主要有Taq酶、Mg²⁺濃度、擴增反應(yīng)溫度和時間、循環(huán)周期、引物、dNTPs濃度和DNA濃度及純度等。因而在實驗前要對反應(yīng)體系及擴增條件進行充分的優(yōu)化。

（二）注意事項

1．冰上配制PCR反應(yīng)液，然后置于PCR儀上進行反應(yīng)。

2．DNA質(zhì)量要求高，應(yīng)純化并特別注意防止氧化。

3．反應(yīng)靈敏，易產(chǎn)生污染而造成假陽性，因此要有對照反應(yīng)。

4．注意影響因素，并注意“平臺效應(yīng)”的產(chǎn)生。

5．若產(chǎn)物的特異性較低，則可在反應(yīng)混合物中加入5%的二甲基亞礬（DMSO）等以提高產(chǎn)物特異性。

6．如若產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分辨率較低，則可用聚丙烯酰胺凝膠或梯度凝膠電泳方法來提高分辨率。

五、所用儀器、耗材

PCR儀；微量移液器；離心機；紫外分析儀；電泳裝置；PCR管；無菌Tip頭；玻璃器皿等

六、所需試劑

10×PCR Buffer；模板DNA；dNTPs（2.5mM）；MgCl₂（25mM）；隨機引物（20μM）；Taq酶（2.5U/μl）；加樣緩沖液；瓊脂糖等。

七、思考題

1．試述RAPD技術(shù)與PCR技術(shù)的區(qū)別。

2．試述為什么RAPD技術(shù)重復(fù)性較差？

實驗七 甜菜M14品系AFLP分析

一、相關(guān)知識

（一）基因組DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切

在基因工程技術(shù)中，酶切反應(yīng)為一個關(guān)鍵性的操作過程，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，將載體切成符合要求的片段，以便于外源基因的插入。核酸內(nèi)切酶就是從DNA鏈的內(nèi)部進行切割的酶。核酸內(nèi)切酶分為兩類，一類稱為非限制性內(nèi)切酶，另一類稱為限制性內(nèi)切酶。非限制性內(nèi)切酶就是指那些不識別特定的DNA序列進行切割的內(nèi)切酶，如脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ），是從牛的胰腺中提取出來的內(nèi)切酶，DNase Ⅰ對單、雙鏈DNA都很敏感。它可以在DNA鏈內(nèi)的任意位置切斷磷酸二酯鍵，沒有特定的識別序列。一般說來，經(jīng)DNase Ⅰ酶解處理過的DNA體系中最終只會剩下被降解下來的單核苷酸和很短的寡聚核苷酸鏈。

限制性內(nèi)切酶則與非限制性內(nèi)切酶相反。它們都能識別一定的DNA序列，在一定的條件下切斷DNA鏈。限制性內(nèi)切酶分成三種類型，即類型Ⅰ限制性內(nèi)切酶識別的DNA序列長約十幾個核苷酸，或甲基化，或在離該識別序列一端約1000bp的位置上切割DNA，類型Ⅰ限制性內(nèi)切酶只特定地識別DNA序列，而切割位點卻不特定；類型Ⅲ限制性內(nèi)切酶與類型Ⅰ限制性內(nèi)切酶有些不同，它也可識別特定的DNA序列，但它切割DNA的位點，往往在識別結(jié)合位點很相鄰的位置上而不是1000bp那么遠；盡管如此，它的切割位點仍就不特異。因而Ⅰ型限制性內(nèi)切酶與 Ⅲ 型限制性內(nèi)切酶在基因操作技術(shù)中的應(yīng)用前景并不廣泛。類型Ⅱ限制性內(nèi)切酶不但能特異識別DNA序列，而且識別的DNA序列與酶切割DNA的位置是一致的，它避免了酶切末端的不確定性和可重復(fù)性，因而在基因重組技術(shù)中有廣泛使用。大多數(shù)的限制性內(nèi)切酶并不是在DNA兩條鏈的同一個位置切斷的，而是兩條鏈錯開兩至四個核苷酸斷裂，這樣產(chǎn)生的DNA末端會帶有5′突出或是3′突出的DNA單鏈，這種末端稱為粘性末端。

酶切通常根據(jù)操作目的的不同而選擇不同的酶切方式，如單酶切、雙酶切、部分酶切等等。單酶切是DNA片段化最常用的方法，用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA樣品。而雙酶切的兩種限制性核酸內(nèi)切酶可以先后分別在不同的反應(yīng)系統(tǒng)中切割DNA樣品。采用這種方法，應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割，然后調(diào)節(jié)緩沖液的鹽濃度，再加入需要較高鹽濃度緩沖液的酶進行切割。如果兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，則應(yīng)先用最適反應(yīng)溫度較低的酶進行切割，升溫后再加入第二種酶進行切割。若兩種限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)系統(tǒng)相差很大，會明顯影響雙酶切結(jié)果，則可以在第一種酶切割后，經(jīng)過凝膠電泳回收需要的DNA片段，再選用合適的反應(yīng)系統(tǒng)，進行第二種限制性核酸內(nèi)切酶的切割。

（二）粘性末端的連接

在細(xì)胞中，行使連接功能的是連接酶（ligase），這是一類很特殊的酶，它催化DNA或RNA相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA單鏈缺口封合起來。常用的連接酶主要有DNA連接酶和RNA連接酶，其主要作用為間斷修復(fù)功能和連接功能。

理論上講，連接反應(yīng)的**溫度是37℃，因為在37℃時連接酶的活性最高，但在實際實驗中，37℃時粘性末端DNA分子形成的配對結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此，人們需要找到一個最適溫度，它既要利于最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又要有助于短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。目前，常用的連接溫度為12-16℃。

由于粘性末端比平末端具有更高的連接效率，因此，在做DNA重組連接實驗過程中，人們往往優(yōu)先選擇粘性末端連接。但實際上，并不是所有的連接都已具備了合適的粘性末端，例如大多數(shù)情況下一個是粘性末端分子，另一個是平末端DNA，或是兩個分子分別具有不同的粘性末端等等。在這些情況下，人們可以采用銜接體（linker）技術(shù)、接合體（adaptor）技術(shù)和同聚體（homo polymer）加尾技術(shù)等。

（三）選擇性PCR擴增

原理與標(biāo)準(zhǔn)的PCR完全相同，區(qū)別僅在于PCR所用引物不同。標(biāo)準(zhǔn)PCR的引物為已知序列互補的核苷酸順序，而選擇性擴增中，針對中間未知的核苷酸順序人為的在已知順序引物的后面隨機加上1~3個堿基（要保證一定的GC含量），這樣只有與隨機的三個堿基互補配對的片段才可能從大量的片段中被擴增出來，因而可根據(jù)選擇性堿基的數(shù)目來控制擴增片段的多少，達到選擇性的目的。

引物的組成：（1）核心堿基序列，該序列與人工接頭互補；（2）限制性內(nèi)切酶識別序列；（3）引物3′端選擇堿基。

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳

依據(jù)制備凝膠的材料，凝膠電泳可分成兩個亞類：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA/RNA（5—500bp）****，其分辨力極高，相差1bp的DNA片段就能分開，其不足之處為制備和操作較為困難。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為200bp至近50kb的DNA/RNA片段。

常用聚丙烯酰胺凝膠有以下兩種：

（1）用于分離和純化雙鏈DNA片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠

大多數(shù)雙鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率大略與其大小的1g對數(shù)值成反比，但遷移率也受其堿基組成和序列的影響，以致大小完全相同的DNA，其遷移率可相差達10%，這種作用是由于雙鏈DNA在特定序列上形成扭結(jié)而造成的。

（2）用于分離、純化單鏈DNA的變性聚丙烯酰胺凝膠

這些凝膠在一種可以抑制核酸中的堿基配對的試劑（如尿素或甲醛）存在下聚合，變性DNA在這些凝膠中的遷移速率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。放射性DNA探針的分離、S₁核酸酶消化產(chǎn)物的分析及DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的分析，均采用變性聚丙烯酰胺凝膠。

（五）AFLP技術(shù)

1．AFLP技術(shù)的優(yōu)點

理論上由于AFLP采用的限制性內(nèi)切酶和選擇性堿基的種類、數(shù)目較多，所以AFLP可產(chǎn)生的的標(biāo)記數(shù)目是無限的；基因型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)非變性PAGE電泳檢測到的譜帶數(shù)在50～100條之間，所以該技術(shù)是DNA多態(tài)性檢測的一個非常有用的技術(shù)；AFLP標(biāo)記是典型的孟德爾方式遺傳；AFLP分析的大多數(shù)擴增片段與基因組的單一位置相對應(yīng)，因此AFLP標(biāo)記可以用于作為遺傳圖譜和物理圖譜的位標(biāo)；AFLP 既可以用于分析不同復(fù)雜程度的基因組DNA，也可用于分析克隆的DNA大片段，因此它不僅是一種DNA指紋技術(shù)，也是基因組研究的一個非常有用的工具；DN A的隨機擴增，受模板濃度的影響較大，而AFLP的一個重要特點是對模板濃度變化不夠敏感。VOs等人在西紅柿的 AFLP分析過程中發(fā)現(xiàn)模板濃度相差1000倍的范圍內(nèi)，得到的結(jié)果基本一致。只是模板濃度很低時，譜帶較弱，甚至有缺失；AFLP技術(shù)另一個重要特點是，在反應(yīng)過程中，標(biāo)記的引物會全部耗盡，當(dāng)引物耗盡后，擴增帶型將不受循環(huán)數(shù)的影響。由于AFLP對模板濃度不敏感，這樣利用過剩的循環(huán)數(shù)，即使模板濃度存在一些差異，也會得到強度一致的譜帶。因此AFLP技術(shù)能夠檢測譜帶強度的多態(tài)性。

2．AFLP與其它分子標(biāo)記技術(shù)的比較

每一種分子標(biāo)記都具有其優(yōu)點和缺點。對于相同的材料，用不同的分于標(biāo)記揭示的多態(tài)性是存在差異的，一般AFLP的多態(tài)性比率最大，RFLPRAPD次之。Wang等在對水稻溫敏不育等位系的研究中報道，三種分子標(biāo)的多態(tài)性比率依次為AFLP〉RAPD〉RFLP（26.67%；4.00%；1.67%）。同時Lin等在大豆的分析中同樣證明AFLP的多態(tài)性最高。

特性 RFLP RAPD AFLP

分布普遍普遍普遍

可靠性高中等高

重復(fù)性高中等高

遺傳性共顯性顯性顯性或共顯性

多態(tài)性中等高非常高

DNA需求 2－30ng 1-100ng 100ng

放射性一般有無有或無

技術(shù)難度中等簡單中等

樣品生產(chǎn)率中低高非常高

時間因素長快中等

與其它分子標(biāo)記相比，AFLP的特點主要表現(xiàn)在它結(jié)合了RFLP及RAPD各自的優(yōu)點，方便快速，只需要極少量DNA材料，不需要Southern雜交，不需要預(yù)先知道DNA的順序信息，試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以快速獲得大量的信息。而且再現(xiàn)性高，重復(fù)性好，因而非常適合于品種指紋圖譜的繪制，遺傳連鎖圖的構(gòu)建及遺傳多樣性的研究。在一些多態(tài)性很少而且待測樣品較少的情況下，用AFLP分析能達到滿意的結(jié)果。對高密度基因圖譜的繪制或?qū)δ硞€基因所在區(qū)域的精細(xì)作圖，AFLP是較為理想的方法。AFLP所產(chǎn)生的多態(tài)性遠遠超過了RFLP、RAPD等，目前被認(rèn)為是DNA指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最為豐富的一項技術(shù)。

3．AFLP技術(shù)的應(yīng)用

AFLP技術(shù)誕生以來，己廣泛地用于生物的基因組分析。如植物的抗性基因定位及染色體作圖，病原菌的親緣關(guān)系分析。由于它對基因組的微小變化具有較好的分辨能力，因而它也被廣泛地用于同一病原真菌的營養(yǎng)體的親和群及病菌的無毒基因與病菌的毒性分析。

①AFLP技術(shù)用于細(xì)菌的分類和鑒定的研究

ALFP的可重復(fù)性比RAPD要強，在細(xì)菌分類方面的適用范圍與RAPD、RFLP和細(xì)菌可溶性蛋白質(zhì)譜相似。但AFLP綜合以上各方法的優(yōu)點，分辨率僅低于全基因組序列分析，穩(wěn)定性強，可提供更為豐富的分類信息。

②AFLP技術(shù)用于真菌分類研究

AFLP是一種強有力地表示真菌分子特征的新技術(shù)，其操作過程方便，區(qū)分鑒定結(jié)果可靠，該技術(shù)在病原真菌方面的應(yīng)用己十分引人注目，己發(fā)展出一些實用的程序來區(qū)別一些特殊菌株，用于分型、鑒定并研究其親緣關(guān)系。它可以分析其不同種屬間的差別，甚至還可以揭示種內(nèi)不同菌株間的細(xì)微差異，從而彌補了表型分型的不足，更為精確地分析致病真菌本質(zhì)上的差異。該技術(shù)被應(yīng)用于鐮刀菌（Fusarmiu graminearum）不同來源分離株的鑒定和區(qū)別，得到了良好結(jié)果。

二、實驗原理

1991年，Gustava等人用非常短的5個堿基、8個堿基及10個堿基的寡核苷酸片段作引物，隨機擴增人、動物、植物、真菌、細(xì)菌以及病毒DNA獲得成功，他們稱之為擴增片段長度多態(tài)性（Amplification Fragment Length Polymorphisms，AFLP）。1992年由Zabeau 和Vos創(chuàng)立的AFLP技術(shù)與前述內(nèi)容大不相同，該方法結(jié)合了RFLP(restriction fragment Length polymorphisms)技術(shù)和RAPD技術(shù)的特點，使用人工接頭（Adaptor）與限制性內(nèi)切酶酶切的基因組DNA片段連接并以此為DNA模板，合成系列3`—末端隨機變化數(shù)個堿基且與人工接頭序列相互補的PCR引物，來進行PCR特異條件擴增，經(jīng)電泳檢測后可獲得DNA指紋圖譜。

基因組DNA

CTGCAGNNNN…NNNNCTGCAG…

GACGTCNNNN…NNNNGACGTC

PstⅠ酶切

GNNNN…NNNNCTGCA

ACGTCNNNN…NNNNG

加人工接頭

5’---CTCGTAGACTGCGTACATGCA---3’

3’--- CATCTGACGCATGT ---5’

T4連接酶連接

lCTCGTAGACTGCGTACA TGCA GNNNN…NNNNCTGCA

CATCTGACGCATGT ACGT CNNNN…NNNNG

選擇引物PCR擴增

CTCGTAGACTGCGTACATGCAGNNNN…NNNNCTGCA

CATCTGACGCATGTACGTCNNNN…NNNNG

Ps1--GACTGCGTACATGCAGACC

Ps2—GACTGCGTACATGCAGCTG

凝膠檢測

（一）基因組DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切

限制性內(nèi)切酶的作用效率是受多方面因素影響的，如反應(yīng)溫度、緩沖體系、離子種類與濃度、DNA的純度、DNA分子的甲基化程度等等。限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液中一般含有MgCl₂，NaCl或KCL，Tirs-HCl，二硫蘇糖醇（DTT）或β-疏基乙醇，有的還含有牛血清蛋白（BAS）。Mg²⁺是限制性內(nèi)切酶的輔助因子，Tris-HCL保持整個反應(yīng)體系的pH值；不同的酶對于Na⁺或K⁺有不同的要求，DTT和β-疏基乙醇有助于酶在體系中的穩(wěn)定。

DNA的純度對于酶切效果影響很大，因為蛋白質(zhì)、酚、氯仿、SDS等雜質(zhì)污染DNA以后，能直接抑制酶的活性。在實驗時，為了克服這些雜質(zhì)的影響，采取的措施或者是延長反應(yīng)時間，或是增加酶量，也可以既增加酶量，又延長反應(yīng)時間取得好的反應(yīng)效果。

不同的限制性內(nèi)切酶，其最適反應(yīng)溫度也可能不同，內(nèi)切酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度為37℃，但也有許多例外，如Sma I 的最適反應(yīng)溫度為25℃，Taq I 的最適反應(yīng)溫度為65℃。內(nèi)切酶的活性定義：在50 μL反應(yīng)液中，適宜的溫度下反應(yīng)1小時，將1μg的λDNA完全分解的酶量定義為1個活性單位。

限制性內(nèi)切酶的貯存液通常含有50%的甘油，而甘油在反應(yīng)體系中超過5%時，就會影響酶切的特異性，因此作酶切反應(yīng)時加入酶的體積不應(yīng)超過反應(yīng)總體積的1/10。

酶切的時間因?qū)嶒灦?，是?/span>DNA樣品的濃度、純度及酶的濃度決定的。DNA樣品濃度高、純度差或酶的濃度太低都可以適當(dāng)延長酶切時間。酶切體系的體積一般以20-50 μL為宜。如果DNA樣品是基因組DNA，那么時間可以延長至18個小時或過長。

EcoR Ⅰ：

5′----GAATTC---3′ 5′---G AATTC---3′

3′----CTTAAG---5′ 3′---CTTAA G---5′

Pst Ⅰ:

5′---CTGCAG---3′ 5′---CTGCA G---3′

3′---GACGTC---5′ 3′---G ACGTC---5′

BamH Ⅰ:

5′---GGATCC---3′ 5′---G GATCC---3′

3′---CCTAGG---5′ 3′---CCTAG G---5′

（二）接頭的連接

（三）選擇性PCR擴增

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠（poLyacryLamide geL, PAG）是由丙烯酰胺（acryLamide）和交聯(lián)試劑N，N’—甲叉雙丙烯酰胺（Bis；N，N’—methyLenebisacryLamide）在有引發(fā)劑如過硫酸胺和增速劑如N,N,N’,N’—四甲基乙二胺(TEMED)存在的情況下聚合而成的。丙烯酰胺的單體形成長鍵，由N,N’—甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團和鏈末端的自由功能基團反應(yīng)而發(fā)生交朕形成凝膠，凝膠的孔徑由鏈長和交聯(lián)度所決定。

聚丙烯酰胺凝膠的制備和電泳都比瓊脂糖凝膠更為費事。聚丙烯酰胺凝膠幾乎總是裝于兩塊玻璃板之間，兩塊玻璃板由間隔片隔開,并封以絕緣膠布。在這種配置的形式下，大多數(shù)丙烯酰胺溶液不會與空氣接觸，所以氧對聚合的抑制局限于凝膠頂部的一個窄層里。聚丙烯酰胺凝膠一律是進行垂直電泳，根據(jù)分離的需要，其長度可以在10—100cm之間。聚丙烯酰胺凝膠與瓊脂糖凝膠相比有3個主要優(yōu)點：①分辨力強，長度僅僅相差0.2% (即500bp中的1bp）的DNA分子即可分開；②所能裝載的DNA量遠遠大于瓊脂糖凝膠，多達10μg的DNA可以加樣于聚丙烯酰胺凝膠的一個標(biāo)準(zhǔn)樣品槽而不致顯著影響分辨力；③從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可適用于要求最高的實驗。

三、實驗方法

（一）基因組DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切

1．本試驗所用DNA為從甜菜葉中提取的基因組DNA，選用三種限制性內(nèi)切酶進行單酶切反應(yīng)，分別為Pst Ⅰ、和BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶。

2．取三個0.5mL離心管，按順序加入以下成分，反應(yīng)總體積為 20μL。

滅菌水 16μL

10×限制性內(nèi)切酶緩沖液 2 μL

基因組DNA（1mg/mL） 2 μL

限制性內(nèi)切酶 1 μL

3．上下吸打混勻，快速離心收集使溶液全部聚于管底部，將離心管放在水浴中，根據(jù)不同酶的**作用溫度保溫2.5—4 h。

4．置65℃水浴中滅活15分鐘，終止酶切反應(yīng)。

5．取10 μL酶切過的溶液，加入2 μL 6×上樣緩沖液在1% 瓊脂糖凝膠上電泳，電泳時以分子量Marker為分子量對照，電泳電流為60--100mA。

6．電泳結(jié)束后，在紫外燈下進行觀察，酶解完全的總DNA在泳道上應(yīng)呈均勻的彌散狀，其中還經(jīng)常可見亮一些的條帶，這些是重復(fù)序列。

（二）接頭的連接

1．每種限制性內(nèi)切酶都有各自配對的接頭，其序列具體如下：

EcoR Ⅰ：

Ead1： 5′--CTC GTA GAC TGC GTA CC--3′

Ead2： 3′--CAT CTG ACG CAT GGT TAA--5′

Pst Ⅰ：

Pad1： 5′--CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA--3′

Pad2： 3′--CAT CTG ACG CAT GT--5′

BamH Ⅰ：

Bad1： 5′--GGG TCG AAT TCG AGC TCA G--3′

Bad2： 3′--CCC AGC TTA AGC TCG AGT CCT AG--5′

2．接頭的制備：

①先將接頭中每個單鏈部分配制成濃度為50μM的溶液，根據(jù)摩爾數(shù)計算加水量；

②分別從兩管中取25μL溶液加入PCR管中，經(jīng)94℃變性2min，36℃退火5min后，自然冷卻至室溫，兩個互不寡聚核苷酸鏈便結(jié)合成為人工接頭，做好標(biāo)記備用。

3．制備連接反應(yīng)體系：

取一支PCR管，冰上依次加入下列成分：

酶切模板DNA 250 ng（5 μL）

25μM接頭 0.2 μL

T₄ Ligation Buffer 5 μL

T₄ Ligase（3U/μL） 0.6 μL

ddH₂O 39.2 μL

總體積 50 μL

4．吸打混勻，16℃條件O/N，進行連接反應(yīng)。

5．加0.1×TE Buffer至終體積250 μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

（三）選擇性PCR擴增

1．三種限制性內(nèi)切酶用到的選擇擴增引物，其序列具體如下：

EcoR Ⅰ：

Es1： 5′--GAC TGC GTA CCA ATT CGT C--3′

Es2： 3′--GAC TGC GTA CCA ATT CAG C--5′

Pst Ⅰ:

Ps1： 5′--GAC TGC GTA CAT GCA GCT G--3′

Ps2： 3′--GAC TGC GTA CAT GCA GAC C--5′

BamH Ⅰ:

Bs1： 5′--TTC GAG CTC AGG ATC CGT G--3′

Bs2： 3′-- GAG CTC AGG ATC CAC G--5′

2．選擇引物的制備：

使用前根據(jù)摩爾數(shù)將引物配制成終濃度66 ng/μL，備用。

3．制備PCR反應(yīng)體系：

取一支PCR管，冰上依次加入下列成分：

10×PCR Buffer 2.0 μL

2.5 mM dNTP 1.6 μL

25 mM MgCl₂ 1.2 μL

選擇引物 1.0 μL

TaKaRa Ex Taq（5U/μL） 0.2 μL

連接模板DNA 10.0 μL

ddH₂O 4.0 μL

總體積 20 μL

4．吸打混勻，離心收集。

5．PCR儀擴增，循環(huán)程序如下：

94℃，5 min

94℃，30 sec

68℃，30 sec（每個循環(huán)降低0.7℃） 12 Cycles

72℃，1 min

94℃，30 sec

56℃，30 sec 23 Cycles

72℃，1 min

72℃，5 min

4℃保存，Hold。

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

1．已商品化的電泳裝置有多種類型，而玻璃板與間隔片之間的配置也因制造廠商的不同而略有差異，間隔片的厚度介于0.5—2.0mm。凝膠越厚，電泳時產(chǎn)生的熱量就越大,過熱會導(dǎo)致出現(xiàn)“微笑”DNA條帶或其他問題，因此，凝膠薄一點更好。在玻璃板與間隔片之間要形成不透水密封，以免未聚合的凝膠溶液漏出。一般兩塊玻璃板的大小略有差別。本實驗所用的電泳槽為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY—III 28D型電泳槽。實驗前，把玻璃板及橡膠框要徹底清洗，然后分別把兩塊玻璃板插入橡膠框中，其中小玻璃板插入帶有下凹槽的縫中。用瓊脂糖（1~1.2%）將大、小玻璃板的底部封住。一個電泳槽有兩個這樣的橡膠框。

2．將載有玻璃板的兩個橡膠框分別放入電泳槽的夾隔中，其中短玻璃一面向內(nèi)，固定位置，擰緊兩側(cè)及底部的螺絲。

3．拿兩個50mL小燒杯，按下表分別配制40mL的聚丙烯酰胺凝膠溶液。在配制聚丙烯酰胺凝膠溶液時，可以先把水、40%丙烯酰胺、5×TBE和10%過硫酸胺混合，等到灌膠前再加入TEMED，否則凝膠要很快聚合。

4．將電泳槽斜靠在一白色瓷盤邊上，與桌面大約成10—20°角，向混合液中加入TEMED，旋動燒杯以混勻溶液。

試劑	制備不同濃度（%）凝膠所用試劑的毫升數(shù)（總體積40mL）
試劑	6%	5.5%	5%	4%
H₂O 25.6mL		26.1mL	26.6mL	27.6mL
40%丙烯酰胺 6mL		5.5mL	5mL	4mL
5×TBE 8mL		8mL	8mL	8mL
10%過硫酸胺 360μL		360μL	360μL	360μL
TEMED 40μL		40μL	40μL	40μL

5．將燒杯中的溶液沿下方的橡膠框中的長玻璃液一側(cè)倒入兩塊玻璃板的空隙處，注滿至頂部，如有氣泡，用一細(xì)棒將其排出。

6．立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，梳子平的一?cè)要靠近長玻璃板。

7．將電泳槽反轉(zhuǎn)過來，使另一個沒有灌膠的橡膠框處在下方，用同樣方法灌膠。

8．將電泳槽放正，在室溫下聚合60分鐘。如果凝膠明顯收縮，應(yīng)補加丙烯酰胺溶液。聚合完全后，在梳子下方可以看見折射率不同的紋線。

9．如果不接通冷卻水循環(huán)裝置，應(yīng)用夾子夾緊連接貯液槽的兩根橡膠管。

10．凝膠聚合完畢后，小心取出梳子，立即用水沖洗加樣孔，用1×TBE灌滿電泳槽的緩沖液槽。

11．接上電極，上貯液槽導(dǎo)線與電泳儀的負(fù)極相連（黑對黑），下貯液槽導(dǎo)線與電泳儀的正極相連（紅對紅），設(shè)定電壓及電流，按下電泳儀的工作開關(guān)，進行預(yù)電泳20—30分鐘以除去加樣孔處的雜質(zhì)。

12．將工作開關(guān)放到預(yù)置擋的位置，將DNA樣品與適量的凝膠加樣緩沖液混合，用移液槍吸取混合液，將Tip頭靠近加樣孔對應(yīng)的長玻璃板注入樣品。

13．設(shè)定好電壓及電流(一般設(shè)置恒流30 mA，亦可在200V)，按下電泳儀的工作開關(guān)，進行電泳（大約3—4個小時）。

14．電泳至標(biāo)準(zhǔn)參照前沿指示劑位置時，切斷電源，撥出導(dǎo)線，棄去緩中液槽內(nèi)的電泳緩沖液，擰開固定螺絲，卸下玻璃板和橡膠框，用薄鋼勺將上面的玻璃板從一角撬起，用洗瓶沖洗凝膠，使凝膠完全附在一個玻璃板上，再用洗瓶沖洗凝膠與玻璃板的空隙，使凝膠徹底與玻璃板分離，用水的力量把凝膠沖入白瓷盤中，（在此過程中，切勿用手及其它工具接觸凝膠）。

15．用去離子水清洗凝膠3次，然后放入固定液中（固定液的體積以沒過膠面0.5cm為宜）固定10分鐘。

16．倒掉固定液，用去離子水清洗凝膠3次，然后放入染色液染色10分鐘。

17．倒掉染色液，用去離子水清洗凝膠3次，然后放入顯影液中顯影10—20分鐘。

18．等到DNA條帶清晰顯現(xiàn)出來時，凝膠再用清水沖洗一遍，然后用10%甘油浸泡過的玻璃紙包好（不要有氣泡），用夾子固定在玻璃板上，在室溫下自然封干一夜，封干后取下干膠，進行區(qū)帶分析。

19．觀察記錄，結(jié)果分析。

四、實驗要點

1．酶切時一般的加樣次序為水、buffer、DNA，最后加酶液。

2．酶切反應(yīng)為微量操作，Tip要從溶液表面吸取，以防止Tip沾去過多液體與酶，待用的內(nèi)切酶要放在冰浴內(nèi)，用后蓋緊蓋子，立即放回－20℃冰箱，防止限制性內(nèi)切酶的失活。

3．由于溫差原因，往往在酶切反應(yīng)的離心管蓋上有水汽，因此樣品酶切完畢或中間取樣要離心2秒，以集中溶液,否則會發(fā)現(xiàn)酶切后體積減小。

4．若電泳條帶靠近加樣孔的一端比另一端亮得多，表明酶切不完全，這可能是因為以下幾個原因：

①反應(yīng)時間不夠長（若反應(yīng)過夜則可排除此項）。

②酶量不夠或酶部分失活，當(dāng)一管酶加到最后時常會碰到后一種情況。

③如果DNA樣品溶于TE緩沖液中且在酶解反應(yīng)中所占的體積較大時，TE緩沖液中的EDTA可能抑制酶解反應(yīng)，這時可用乙醇重新沉淀DNA，其步驟為加入1/10體積的3M NaAC，再加入2.5倍體積的無水乙醇，離心（14000g×15min），去上清，再加入75%乙醇（50 μL）洗DNA沉淀，再離心（14000g×15min），去上清，干燥后重新溶于少量TE緩沖液或SWD中。

5．若泳道中的DNA系帶混雜，可能是由于DNA樣品在初始緩沖液中只是部分溶解或者是因為乙醇沉淀后DNA樣品中仍殘存有乙醇。

6．電泳條帶下部較其他部位亮得多，這可能是因為樣品中混有RNA或DNA樣品發(fā)生了降解。

五、所需儀器、耗材

1．30℃、37℃、65℃水浴 2．電泳儀

3．水平電泳槽 4．垂直板電泳槽

5．移液槍 6．凍冷離心機

7．紫外觀測儀 8．高壓滅菌鍋

9．紫外凝膠成像系統(tǒng) 10．磁力攪拌器

11．酸度計 12．島津紫外分光光度計

13．超低溫冰箱 14．純水儀

15．低溫循環(huán)水浴鍋 16．超速離心機

17．冰箱 18．鼓風(fēng)干燥箱

19．冷凍干燥離心機 20．PCR儀

21．離心管 22．各種細(xì)口瓶及燒杯

23．夾子 24．玻璃紙

25．洗瓶 26．單面刀片

27．Tip頭 28．PCR管

六、所需試劑

1．基因組DNA（1mg/mL） 2．分子量Marker

3．1×TBE配制的1%瓊脂糖 4．溴化乙錠貯液（10mg/mL）

5．滅菌蒸餾水（SDW） 6．限制性內(nèi)切酶及酶切反應(yīng)緩沖液

7．3M NaAC 8．乙醇

9．上樣緩沖液 10、Tris-HCl

11．硼酸 12．EDTA（乙二胺四乙酸）

13．過硫酸銨 14．TEMED（N-N-N’-N’-四甲基乙二胺）

15．冰醋酸 16．硝酸銀

17．氫氧化鈉 18．甲醛

19．丙烯酰胺 20．甲叉雙丙烯酰胺（Bis）

七、試劑配制

1．5×TBE

終體積1L 終體積500mL

Tris-HCl 54g 27g

硼酸 27.5g 13.75g

0.5moL/L EDTA

(pH=8.0) 20mL 10mL

2．0.5moL/L EDTA（pH=8.0）

在800mL水中加入186.1g EDTA-Na₂·2H₂O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。

3．10% 過硫酸銨

過硫酸銨1g定容至10mL或者過硫酸銨0.1g定容至1mL。

4．TEMED：商品試劑

5．固定液：10%乙醇，0.5% 冰醋酸

配制：50mL乙醇,2.5mL冰醋酸定容至500mL。

6．染色液： 10%乙醇，0.5%冰醋酸，0.2%硝酸銀

配制：50mL乙醇，2.5mL冰醋酸，1g硝酸銀定容至500mL，避光保存。

7．顯影液：3%氫氧化納，0.5%甲醛

配制：15g氫氧化納，6.8 mL 37% 甲醛定容至500mL。

8．40%丙烯酰胺（19：1）：

丙烯酰胺38g，甲叉雙丙烯酰胺2g加50mL水將溶液加熱37℃，定容至100mL.

9．1% 瓊脂糖：0.24g瓊脂糖加20mL水，在微波爐中加熱。

八、思考題

1．影響酶切的因素有哪些？

2．酶切反應(yīng)不完全的因素有哪些？

3．簡單描述粘性末端的三種連接技術(shù)

4．與瓊脂糖凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠主要有哪些優(yōu)點？

5．在制備聚丙烯酰胺凝膠時，過硫酸胺和N,N,N’,N’—四甲基乙二胺（TEMED)的作用是什么？

6．試比較AFLP技術(shù)與RAPD技術(shù)。

實驗八 生物信息學(xué)

一、相關(guān)知識

（一）生物信息學(xué)的定義

生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學(xué)。它是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的重大前沿領(lǐng)域之一，同時也將是21世紀(jì)自然科學(xué)的核心領(lǐng)域之一。其研究重點主要體現(xiàn)在基因組學(xué)(Genomics)和蛋白學(xué)(Proteomics)兩方面。

廣義地說，生物信息學(xué)從事對基因組研究相關(guān)生物信息的獲取、加工、儲存、分配、分析和解釋。這一定義包括了兩層含義，一是對海量數(shù)據(jù)的收集、整理與服務(wù)，也就是管好這些數(shù)據(jù)；另一個是從中發(fā)現(xiàn)新的規(guī)律，也就是用好這些數(shù)據(jù)。
　　具體地說，生物信息學(xué)是把基因組DNA序列信息分析作為源頭，找到基因組序列中代表蛋白質(zhì)和RNA基因的編碼區(qū)；同時，闡明基因組中大量存在的非編碼區(qū)的信息實質(zhì)，破譯隱藏在DNA序列中的遺傳語言規(guī)律；在此基礎(chǔ)上，歸納、整理與基因組遺傳信息釋放及其調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄譜和蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，從而認(rèn)識代謝、發(fā)育、分化、進化的規(guī)律。
　　生物信息學(xué)還利用基因組中編碼區(qū)的信息進行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的模擬和蛋白質(zhì)功能的預(yù)測，并將此類信息與生物體和生命過程的生理生化信息相結(jié)合，闡明其分子機理，最終進行蛋白質(zhì)、核酸的分子設(shè)計、藥物設(shè)計和個體化的醫(yī)療保健設(shè)計。

（二）研究生物信息學(xué)的必要性

首先伴隨著基因組研究，相關(guān)信息出現(xiàn)了爆炸性增長，迫切需要對海量生物信息進行處理。自1995年科學(xué)家破譯了全長為180萬核苷酸的嗜血流感桿菌基因組以來，到目前已有大約60個微生物和若干真核生物，如：酵母、線蟲、果蠅、擬南芥的完整基因組完成測序。至2001年的春天，科學(xué)家又公布了人類基因組的絕大部分序列，即：人類基因組的工作草圖。這些成就意味著基因組的研究將全面進入信息提取和數(shù)據(jù)分析的嶄新階段。根據(jù)國際數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計，1999年12月DNA堿基數(shù)目為30億，2000年4月DNA堿基數(shù)目是60億，現(xiàn)在這一數(shù)目已達140億，大約每14個月翻一番。同時，電子計算機芯片對于數(shù)字處理能力的增長也相當(dāng)于每18個月翻一番。因此，計算機能夠有效地管理和運行海量數(shù)據(jù)。
　　但是，更為本質(zhì)的原因是基因組數(shù)據(jù)的復(fù)雜性。所謂某種生物的基因組就是指該生物所有遺傳物質(zhì)的總和。生物的遺傳物質(zhì)是一類稱為脫氧核糖核酸（DNA）的生物大分子，它是由4種核苷酸串接起來組成的，通常用字符A、T、G、C代表。通俗地說，生物的遺傳密碼就是這4個字符連接起來的線狀長鏈。這種鏈往往很長，比如：人的遺傳密碼就含有32億個字符，將它們堆起來就構(gòu)成了一部100多萬頁、每頁有3000字符的“天書”。這本“天書”包含了人體的結(jié)構(gòu)和功能以及生命活動過程的大量信息，卻僅僅由4個字符組成，既無詞法，又無句法，還沒有標(biāo)點符號，看起來每一頁都是相似的。如何讀懂它是個極大的難題?；蚪M研究最終是要把生物學(xué)問題轉(zhuǎn)化成對數(shù)字符號的處理問題。要解決這樣的問題就必須發(fā)展新的分析理論、方法、技術(shù)、工具，就必須依賴計算機的信息處理。

（三） 當(dāng)前主要研究內(nèi)容

1．獲取人和各種生物的完整基因組；
2．發(fā)現(xiàn)新基因和新的單核苷酸多態(tài)性；
3．基因組中非編碼蛋白質(zhì)；
4．在基因組水平研究生物進化；

5．完整基因組的比較研究；
6．從功能基因組到系統(tǒng)生物學(xué)；
7．蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬與藥物設(shè)計；
8．生物信息學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展研究。

二、實驗原理

本實驗的主要內(nèi)容是將甜菜中的序列表達標(biāo)簽EST（Expressed sequence taqs）與已知數(shù)據(jù)庫中的信息進行比對，從而掌握對未知序列進行功能分析的基本方法。

EST是長約150～500bp的基因表達序列片段。EST技術(shù)是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并克隆到載體構(gòu)建成cDNA文庫后，大規(guī)模隨機挑選cDNA克隆，對其5′或3′端進行一步法測序，所獲序列與基因數(shù)據(jù)庫已知序列比較，從而獲得對生物體生長發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異、衰老死亡等一系列生命過程認(rèn)識的技術(shù)。

將EST序列與GenBank進行同源性比較，Score值表示相似性程度，Score值越高，相似性（similarity）越大；E Value值表示隨機匹配的可能性，E值越大，隨機匹配的可能性越大；Identity值表示與數(shù)據(jù)庫序列一致性的百分比；Positives 表示兩條序列氨基酸性質(zhì)相似比例；Gaps比對時插入空位的比例；Query為檢測序列；Subject為數(shù)據(jù)庫中的序列。當(dāng)Score≤80時，表示未知的EST是新的；當(dāng)Score值很高時，表示未知的EST與相應(yīng)的已知基因有高度的同源性，由此可推測此EST與已知基因具有相似的功能。

EST序列分析在EST研究中,使用最多的方法就是序列相似性比較，以此來確定EST的功能。BLAST(Basic Local Alignment Search ToolA)是應(yīng)用較廣的工具軟件之一，為同源分析的軟件包，包括有BLASTN、BLASTP、TBLASTN、TBLATX、BLASTX等5個軟件。BLASTN是將核酸序列與核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，BLASTP是將氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行對比，TBLASTN是將蛋白質(zhì)序列與核酸數(shù)據(jù)庫所有6種翻譯序列的對比，TBLASTX是將核酸序列的6種翻譯序列與核酸數(shù)據(jù)庫所有6種翻譯序列的對比，BLASTX是將核酸序列的6種翻譯序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的對比。