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實驗指導
目 錄
實驗一 分子生物學實驗室常用儀器及使用方法
實驗二 質粒DNA的提?。瓑A裂解法
實驗三 瓊脂糖凝膠電泳
實驗四 限制性內切核酸酶的酶切與鑒定
實驗五 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化
實驗六 動物組織細胞基因組 DNA提取
實驗七 DNA的定量
實驗八 PCR基因擴增
實驗九 瓊脂糖凝膠電泳分離與純化目的DNA
實驗十 DNA重組
實驗十一 動物組織細胞總RNA的提取
實驗一 分子生物學實驗室常用儀器及使用
事實證明，在科學飛速發(fā)展的今天，無論從事哪個領域的研究，要想突破，除了有良好的理論基礎外，更重要的是依賴于先進的技術和優(yōu)良的儀器設備以及良好的研究環(huán)境。一個標準的分子生物學實驗室除了具有一般生物學實驗室的常規(guī)儀器設備外，還具有一些特殊用途的儀器，這些儀器一般較精密，價格昂貴。下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項。
一、冷凍離心機
低溫分離技術是分子生物學研究中必不可少的手段?；蚱蔚姆蛛x、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實驗中都離不開低溫離心技術，因此低溫冷凍離心機成為分子生物學研究中必備的重要儀器。在國內，有多個廠家生產冷凍離心機，本實驗室的高速冷凍離心機為GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式轉頭：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。極限轉速20000rpm。
1. 安裝與調試
離心機應放置在水平堅固的地面上，應至少距離10cm以上且具有良好的通風環(huán)境中，周圍空氣應呈中性，且無導電性灰塵、易燃氣體和腐蝕性氣體，環(huán)境溫度應在0～30℃之間，相對濕度小于80%。試轉前應先打開蓋門，用手盤動轉軸，輕巧靈活，無異常現(xiàn)象方可上所用的轉頭。轉子準確到位后打開電源開關，然后用手按住門開關，再按運轉鍵，轉動后立即停止，并觀察轉軸的轉向，若逆時針旋轉即為正確，機器可投入使用。
2. 操作程序
（1）插上電源，待機指示燈亮；打開電源開關，調速與定時系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機器工作轉速的出廠設定，溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時離心腔的溫度。
（2）設定機器的工作參數(shù)，如工作溫度，運轉時間，工作轉速等。
（3）將預先平衡好的樣品放置于轉頭樣品架上，關閉機蓋。
（4）按控制面板的運轉鍵，離心機開始運轉。在預先設定的加速時間內，其運速升 至預先設定的值。
（5）在預先設定的運轉時間內（不包括減速時間），離心機開始減速，其轉速在預先設定的減速時間內降至零。
（6）按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉速值，這時機器已準備好下一次工作。
3. 注意事項
（1）離心機應始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線，機器不使用，要拔掉電源插頭。
（2）開機前應檢查轉頭安裝是否牢固，機腔中有無異物掉入。
（3）樣品應預先平衡，使用離心筒離心時離心筒與樣品應同時平衡。
（4）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時，應使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機腔或造成事故。
（5）除工作溫度、運轉速度和運轉時間外，不要隨意更改機器的工作參數(shù)，以免影響機器性能。轉速設定不得超過最高轉速，以確保機器安全運轉。
（6）使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機器不運轉，應關機斷電，10秒鐘后重新開機，待所設轉速顯示后，再按運轉鍵，機器將照常運轉。
（7）不得在機器運轉過程中或轉子未停穩(wěn)的情況下打開蓋門，以免發(fā)生事故。
（8）每次操作完畢應做好使用情況記錄，并定期對機器各項性能進行檢修。
二、電泳儀
電泳技術是分子生物學研究不可缺少的重要手段。電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳大類，自由界面電泳不需支持物，如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電泳目前已很少使用。區(qū)帶電泳需用各種類型的物質作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠―G薄層等，分子生物學實驗中最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。應用電泳法可以對不同物質進行定性或定量分析，或將一定混合物進行組份分析或單個組份提取制備。下面以DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）為例介紹其使用方法。
1.使用方法
（1）按電源開關，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀…”等字樣后，同時系統(tǒng)初始化，蜂鳴4聲，設置常設置。屏幕轉成參數(shù)設置狀態(tài)，見圖一：
U: 0V U＝ 100V ｜ Mode： STD
I: 0mA I ＝ 50mA ｜
P: 0W P＝ 50W ｜
T: 00:00 T＝ 01:00 ｜
其中:左側大寫U: I: P: T: 為電泳時實際值；中間部分顯示程序的常設值（預置值）。Mode(模式)：STD(標準)；TIME(定時)；VH（伏時）；STEP（分步）
（2）設置工作程序。用鍵盤輸入新的工作程序。例如，要求工作電壓U＝1000V，電流I限制在200mA以內，功率W限制在100W以內，時間T為3小時20分，并且到時間自動關掉輸出。則操作步驟如下：
①按“模式”鍵，將工作模式由標準（STD）轉為定時（TIME）
模式。每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變： STD?TIME?VH?STEP?STD。
②先設置電壓U，按“選擇”鍵，先將其反顯，然后輸入數(shù)字鍵即可設置該參數(shù)的數(shù)值。按數(shù)字1000,則電壓即設置完成。
③設置電流I，按“選擇”鍵，先使I反顯，然后輸入數(shù)字200。
④設置功率P，按“選擇”鍵，先使P反顯，然后輸入數(shù)字100。
⑤設置時間T，按“選擇”鍵，先使T反顯，然后輸入數(shù)字320。如果輸入錯誤，可以按“清除”鍵，再重新輸入。
⑥確認各參數(shù)無誤后，按“啟動”鍵，啟動電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start! 并蜂鳴4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，注意安全。之后逐漸將輸出電壓加至設置值。同時在狀態(tài)欄中顯示“Run”，并有兩個不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實際的工作時間（精確到秒）。
⑦每次啟動輸出時，儀器自動將此時的設置數(shù)值存入“MO”號存儲單元。以后需要調用時可以按“讀取”鍵，再按“0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設置的工作程序取出執(zhí)行。
⑧電泳結束，儀器顯示：“END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時按任一鍵可止鳴。
2.注意事項
(1)U、I、P三個參數(shù)的有效輸入范圍是：U：5～3000V；I： 4～400mA；P：4～400W.
(2)一般情況下，當No Load！時，首先應關機檢查電極導線與電泳槽之間是否有接觸不良的地方，可以用萬用表的歐姆檔逐段測量。
(3)如果輸出端接多個電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時應選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。
(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進風通道。嚴禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進儀器內部。
(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應不避免接觸輸出回路及電泳槽內部，以免發(fā)生危險。
(6）長期不用儀器，應放置在干燥通風的清潔環(huán)境中保存。
三、分析天平
分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方法，是獲得可靠分析結果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天平、半自動/全自動電光分析天平及電子分析天平等。目前實驗室常規(guī)備用的是自動化程度較高的電子分析天平。下面介紹電子分析天平 PL203/01型和AL104/01型 (METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密電子天平：最大稱量210g；實際分度值0.001g；AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱量110g；實際分度值0.0001g
1. 使用方法
（1）檢查并調整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配（使用配置的穩(wěn)壓器），按天平儀器要求通電預熱至所需時間30min 。
（2）打開天平開關“on”，天平則自動進行靈敏度及零點調節(jié)。待顯示屏上所有字段短時點亮，天平回零時，可進行正式稱量。
（3）稱量時將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關上側門，天平將顯示該重量，點擊“?O/T?”鍵自動校對零，然后逐漸加入待稱物質，直至所需重量為止。
（4）稱量結束應及時除去稱量瓶（紙），關上側門，切斷電源，并做好使用情況登記。
2. 注意事項
（1）天平應放置在牢固平穩(wěn)水泥臺或木臺上，室內要求清潔、干燥，同時應避免光線直接照射到天平上。
（2）稱量時應從側門取放物質，讀數(shù)時應關閉箱門以免空氣流動引起天平擺動。
（3）揮發(fā)性、腐蝕性、強酸強堿類物質應盛于帶蓋稱量瓶內稱量，防止腐蝕天平。
（4）電子分析天平若長時間不使用，則應定時通電預熱，每周一次，每次預熱2h，以確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。
四、分光光度計
不同物質對不同波長入射的吸收程度各不相同，從而形成各具特征的吸收光譜 。根據(jù)這一原理，應用比色法可以對某些有色物質進行定性或定量分析。但由于比色法僅限于可見光區(qū)，而且精度低，已遠遠不能滿足高精度微量分析的要求。隨著科學技術不斷發(fā)展，分析儀器也不斷地更新?lián)Q代，人們引進了分光光度法的概念，分光光度計隨之應用。分光光度計由光源、單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成，它不僅適應于可見光區(qū)，同時還擴展至紫外光區(qū)及紅外光區(qū)。光密度（OD）是許多溶液中的溶質定量的指標之一，通過所產生的單色光而測定某一溶液對該單色光的吸收值。分子生物學實驗中常使用紫外分光光度計進行核酸溶液定量和純度的初步判斷。下面介紹紫外可見光分光光度計GeneQantTM Pro（Amersham）的使用方法。該儀器除了能檢測核酸樣品濃度外，還可進行蛋白質濃度以及細胞培養(yǎng)液濃度的測定，能檢測低至幾微升樣品（70μl和5～7μl），樣品無需稀釋，測量后還可全部回收。
使用方法
(1）打開電源開關（ON），等待數(shù)秒鐘，顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù)，如本機型號、當前日期等，這些數(shù)據(jù)可以重新設置，當出現(xiàn)“instrument Ready”即可進入下一程序。
(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測base sep 、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲檢測DNA， 按DNA鍵，即進入DNA檢測程序。在顯示屏上：
Pathlengh 10mm
Units μg/μl
Use 320nm NO
Dilution Faotor 1
Insert reference,
以上為儀器預設置的參考數(shù)據(jù)，若按“enter”鍵，和“select”鍵可以將以上的參數(shù)進行重新設定。
(3）取石英樣品杯70μl或5～7μl ，容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中，然后放入儀器上的樣品槽中，放入時注意樣品杯的光學面朝前方。
(4)按“set ref”鍵，進行空白測試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均“0.000”并提示插入樣品“Insert sample ”。將樣品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同樣吸入待測樣品，放入樣品槽中進行測定。
(5）一個樣品測定完畢，按“stop”鍵，返回“Instrument Ready”。
(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。由于樣品杯十分昂貴，使用時要小心操作。不能用手指拿樣品杯的光學面，用后要及時洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。
五、數(shù)字式酸度計
酸度計是實驗室配置溶液必備的儀器。本實驗室的酸度計為臺式微電腦酸堿度計和溫度計（Hanna）,測量pH范圍為0.00～14.00pH；溫度為0.0～100.0℃；
1. 使用方法
（1）將pH電極和溫度探頭與主機連接，主機與電源連接。
（2）取出電極保護套，如果有結晶鹽出現(xiàn)，這是電極常見現(xiàn)象，浸入水后就會消逝。如果薄膜玻璃或透析膜發(fā)干，可在HI170300電極保存液中浸泡1小時。
（3）pH校準。將pH電極和溫度探棒浸泡在所選的標準緩沖液內4cm（建議用pH6.86、7.01），緩沖液值可通過“D℃”或“?℃”鍵來調節(jié)。按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號及“7.01”數(shù)據(jù)。當讀數(shù)不穩(wěn)定時，屏幕會顯示“NOTREADY”；當讀數(shù)穩(wěn)定時，屏幕會顯示“READY”和“CFM”，按“CFM”鍵確認校準值。確認第一校準點后，將pH電極與溫度探棒浸泡在標準緩沖液內4cm（建議用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號及“4.01”數(shù)據(jù)。按“CFM”鍵確認校正值。
（4）pH測量。校準完畢后，儀器自動進入pH測量狀態(tài)，將電極與溫度探棒浸泡在待測溶液約4cm，停幾分鐘讓電極讀數(shù)穩(wěn)定。
2. 注意事項
（1）由于pH211酸度計內裝有可充電電池，在剛購買或長時間放置后，再使用時，通電校正測量完畢后，可將電源繼續(xù)還插入電源插座，只需關閉開關，這樣可以保證電池充電，是校正值得以儲存，下次測量時無須校正即可進入精確測量。
（2）不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。如果讀數(shù)偏差太大（±1pH），則是由于沒有校正或電極變干。為避免電極受損，在關機前要將pH電極從溶液中拿出。當處于關機狀態(tài)時，在電極浸入電極保存液前，電極要與機器分開。
（3）如儀器已測過幾種不同的樣品溶液，請用自來水清洗，或在插入樣品溶液前，用待測樣品清洗電極。
（4）溫度會影響pH的讀數(shù)，為測量準確的pH值，溫度要在適合的范圍內進行自動溫度補償，用HI7669/2W溫度探棒浸入樣品中，緊靠電極并停幾分鐘，如果被測溶液的溫度已知或測量是在相同溫度下進行，只需動手補償，那么此時溫度探棒是不用連接，屏幕上會顯示溫度讀數(shù)伴有℃信號閃爍。溫度可通過“?℃”或“D℃”來調節(jié)。
六、PCR儀
PCR儀，也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴增儀，它是使一對寡核苷酸引物結合到正負DNA鏈上的靶序列兩側，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列DNA片段，它的每一循環(huán)包括在三種不同溫度進行DNA變性、引物復性、DNA聚合酶催化的延伸反應的三個過程。
PCR儀主要應用于基礎研究和應用研究等許多領域，如基因分析、序列分析、進化分析、臨床診斷、法醫(yī)學等等。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，PCR擴增技術也得到普及推廣應用，因此了解PCR儀的性能，熟練掌握儀器的正確使用方法及使用過程中的注意事項，將是十分必要的。
現(xiàn)介紹PCR 擴增儀（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事項。
1. 使用方法
(1）接通電源開關，儀器進入準備狀態(tài)；在顯示屏上記錄了當前儀器的溫度和蓋子（Lid）的溫度。若儀器正在運行時，須按“ B ”鍵（start/stop），才能退出運行并返回準備狀態(tài)。
(2）編寫程序段。在準備狀態(tài)下按“ C ”鍵(programs)進入編程狀態(tài)，選定一程序號，然后按“enter”鍵，進入下一程序；按 “A”(list)鍵后，選一文件號（empty program）；再按“enter”鍵，進入下一程序；按“ABC”鍵，進入下一程序，用上下左右鍵號選擇一個字母（A、B、C、D、…），然后按“enter”鍵，進入下一程序；按“name ok”鍵，完成文件命名。
(3）設定蓋子的溫度。“lid temp： ℃”，蓋子的溫度一般比變性溫度要高10℃，例如變性溫度是95℃，那么蓋子的溫度就要設定為105℃。待蓋子預熱后按“enter”鍵，進入下一程序。
(4）設定變性溫度、變性時間、延伸溫度、延伸時間、退火溫度、退火時間及循環(huán)總數(shù)等參數(shù)。從第一步依次按“enter”鍵進入，用四個移位鍵移動設定位置。先設定溫度，后設定時間，全部參數(shù)設置完后，按“pgm ok”鍵，所設定的程序自動被保存。
(5）運行程序。檢查設定是否正確， 按“start”鍵，選擇設定好的程序，開始運行。顯示屏上可觀察到系統(tǒng)運行的情況，按“Stop”可停止運行。
七、凝膠成像系統(tǒng)
本系統(tǒng)屬全自動電腦控制影像分析系統(tǒng)，主要拍攝核酸的agarose電泳膠片，及蛋白質的acrylamide電泳膠片。在與markers比較后，可精確計算樣本的分子量，對核酸電泳也可準確定量，是分子生物學及生化蛋白試驗的重要檢測工具。本系統(tǒng)包括暗箱，紫外透射儀，攝像頭，變焦鏡，電腦以及專業(yè)凝膠圖象采集及分析.軟件（3.3版）。該軟件提供對電泳凝膠、斑點測量、PCR密度的定量分析等。此外，還提供圖像采集、標注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā)送到Word、Excel、圖像處理等功能。
1.使用方法
(1) 打開電腦，啟動凝膠分析軟件，進入用戶界面。
（2）打開采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開關，放入凝膠，打開紫外光源或白光光源，將采集裝置與電腦上采集卡相連，然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖像采集”按鈕，出現(xiàn)圖像窗口：“開始采集”、“停止采集”、“采集圖像”等。如果圖像不清晰，可以調節(jié)暗箱上的變焦鏡，使之清晰。可直接將圖像保存起來，也可通過“圖像處理”對圖像進行旋轉、裁剪、濾波、調節(jié)對比度……方面的處理。
(3)對讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動電泳凝膠分析系統(tǒng)。在“功能選擇”菜單中選擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具，將出現(xiàn)泳道分析工具欄，并在“圖像顯示”子窗口中出現(xiàn)一個紅色的矩形框。還可進入“條帶分析”系統(tǒng)，對條帶 進行編號，對二條以上的條帶進行比較。
（4）采集圖像結束后，關閉暗箱電源開關，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。
八、空氣恒溫搖床
搖床（振蕩器）為實驗室的常規(guī)設備。SHK-99-Ⅱ型臺式空氣恒溫搖床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度±0.5℃；時間范圍：1分鐘～99小時59分鐘；轉速范圍：60RPM～250RPM。
1.使用方法
(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：
RPM Temp Time
1 000 00.0 00:00
屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“2”，“Temp”表示溫度，“RPM”表示每分鐘轉速，“Time”表示時間，不設定時可自動累計時間一直運行?！?/span>Temp”、“RPM”、“Time”的值隨時可以修改，隨時按新值運行。
(2）工作程序設置。按“F1”鍵，進入設置狀態(tài)?？稍谒俣?，溫度，時間，運行等四部分之間切換。在每一部分按“F2”鍵輸入數(shù)據(jù)，輸入完十位數(shù)據(jù)，再輸入個位數(shù)據(jù)，按“F2”鍵，再按“F2”鍵，到小數(shù)位，再按“F2”鍵，又到十位，以此循環(huán)。
(3）再按“F1”鍵，轉回運行狀態(tài)，按“Start”鍵，電機開始運行，時間開始計時。
(4）按“End”鍵，結束系統(tǒng)運行。
2. 注意事項
（1）打開電源，系統(tǒng)開始自檢，等待LCD屏幕出現(xiàn)“WELCOME”字樣，系統(tǒng)自檢完畢，可以進行第2步參數(shù)設置。若屏幕出現(xiàn)：a.“TEMP ERROR”，表示溫度檢測線路有錯誤；b.“MOTOR ERROR”，表示電機部分有錯誤。
（2）運行過程可以打開箱蓋，這樣電機不運行，時間也停止，蓋上蓋接著運行。
（3）工作完畢，關閉電源。關機后，要等一段時間再開機。
九、水的凈化裝置
分子生物學實驗對水的純度要求越來越高，一般蒸餾水常常難以滿足實驗要求，大多要求要進行第二次蒸餾（雙蒸水），它可以去除水中的大部分有機雜質，但制作時間較長，而且無機雜質還是很多。許多實驗還需要去離子水，這就需要陰陽離子交換樹脂進行處理。目前，分子生物學實驗室都使用高質量的超純水。如美國微孔濾膜公司的Milli-Q超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學科領域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測序、酶反應、組織和細胞培養(yǎng)等實驗。下面介紹RO-MB壁掛式反滲透高純水機性能及使用方法。RO-MB反滲透高純水機（杭州永潔達）產水量（25℃）10L/H；產水水質：RO純水：<10μs/cm，高純水：>15MΩ.cm；可用自來水制成普通實驗用水和高純水，同時滿足不同水質要求。在線電導率儀對產水水質連續(xù)檢測，可保證產水質量。
1. 使用方法
(1)準備：先檢測與純水機相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開原水閥門。供電電源是否正常，檢查按鈕是否在關閉狀態(tài)（按鈕彈出狀態(tài)）。將電源插頭插入帶有接地線的220V電源插座上。
(2）開機：依次按下電源開關，泵開關，純水機啟動產水，同時廢水排出，指示燈亮起，并處于自動運行狀態(tài)。
(3）取純水：若打開RO純水或高純水出口閥門，則可獲得相應水質的純水。當高純水出口閥門打開時，檢測儀表顯示高純水電導率或電阻值。為了獲得高質量的高純水，可以先放掉一杯水后再取新鮮水。
(4）關機：不用時可關閉個按鈕停機，自來水進水閥門不必關閉，這時機子內部的進水電磁閥已自動切斷水路。只要管路閥門不漏，也可使機子保持自動待機狀態(tài)。
2.注意事項
（1）純水機的正常使用環(huán)境溫度為15～35℃，產水量會隨溫度降低而下降，冬季保養(yǎng)溫度不低于5℃。
（2）預處理濾芯一般三至六個月更換一次，實際使用壽命與自來水水質、總過濾量等有關。
（3）混床濾芯產高純水約1～3噸，約二至四個月更換一次，實際使用壽命與自來水水質、水中含鹽量、總用水量等有關。設備停運時間超過2天。必須注意定期沖洗維護。夏季宜每天開機30分鐘沖洗一次，冬季每隔2～3天開機沖洗一次。
（4）使用過程若發(fā)現(xiàn)停機后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動數(shù)秒鐘又停機，此為管路漏水引起，需及時打開機箱加以解決。若每隔半小時以上啟動數(shù)秒鐘又停機，乃屬正?，F(xiàn)象，有利于沖洗和保護反滲透膜元件，避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積，尤其高溫季節(jié)。
十、消毒設備
細菌和細胞培養(yǎng)以及核酸等有關實驗所用的試劑、器皿及實驗用具，應嚴格滅菌，有的實驗還要求沒有核酸酶的污染，故應將實驗器械，試劑等進行高壓消毒。對于經過導入DNA重組分子的菌株，操作后必須進行嚴格的高壓消毒滅活處理。
大批實驗物品、試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進行消毒。一些不能經受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。所有的細胞培養(yǎng)、細菌培養(yǎng)的操作，都應在紫外線消毒后的超凈工作臺中進行。
下面介紹立式自動壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40BI）的使用方法。
1.使用方法
（1）開蓋：轉動手輪，使鍋蓋離開密封圈。
（2）通電：連接自動進水裝置。接通電源，將控制面板上電源開關按至ON處，若水位低（LOW）紅燈亮，蒸發(fā)鍋內屬斷水狀態(tài)；缺水（LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。
（3）加水：打開水源，水位達到低水位，控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅，加熱（1-綠燈）亮，繼續(xù)加水至高水位（HIGH）綠燈亮，自動停止加水。
（4）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過200mm×100mm×100mm為宜，各包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。
（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內，旋轉手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。
（6）設定溫度：通電后數(shù)顯窗燈亮，上層為紅色，顯示溫度，下層為綠色，設定溫度和時間。先按控制面板上確認鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進入溫度設定狀態(tài)。按一次移位鍵 所指相應位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進行（單項循環(huán)）移位。按△增加鍵或??減少鍵，進行所需溫度設定。設定完畢，按二次確認鍵，進行溫度確認。
（7）設定時間：按一次確認鍵，將溫度設定切換成時間設定；再按一次移位鍵，所指相應位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進行移位；按增加鍵或減少鍵，進行所需時間設定。設定完畢，按二次確認鍵，進行時間設定確認。時間采用倒計時，當滅菌鍋內溫度達到設定溫度，定時器開始倒計時。
（8）滅菌：在加熱初，將下排汽閥打開至垂直位置；下排汽閥待蒸汽冒出時，壓力表顯示指示為100℃時，將下排汽閥推向水平關閉位置；留有微量蒸汽逸出，以控制總汽流量的15%為宜。使用最高滅菌溫度為124℃～126℃，壓力在0.145Mpa～0.165Mpa范圍內屬于安全閥設定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動泄壓，并開始計數(shù)滅菌所需時間。滅菌完成，電控裝置將自動關閉加熱系統(tǒng)，伴有蜂鳴提醒；并將保溫時間切換成END顯示；此時，將控制面板上電源開關按至OFF處；關閉電源，停止加熱待其冷卻。
（9）干燥：物品滅菌后需要迅速干燥，須打開放汽閥和下排汽閥，將滅菌器內的蒸汽迅速排出，使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。
（10）將蓋開啟，取出已滅菌物品。關閉水源，打開下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。
2.注意事項
（1）堆放滅菌物品時，嚴禁堵塞安全閥的出汽孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。
（2）滅菌液體時，應將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過3/4體積為好，瓶口選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，特別注意，在滅菌液體結束時不準立即釋放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。
（3）對不同類型，不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免顧此失彼，造成損失。
實驗二 質粒DNA的提?。瓑A裂解法
一、實驗原理
細菌質粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。
一般分離質粒DNA的方法都包括3個步驟：①培養(yǎng)細菌，使質粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質粒DNA。分離制備質粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質粒分子大小、堿基組成和結構等特點以及質粒DNA的用途進行選擇。本實驗介紹堿裂解法提取質粒DNA。
堿裂解法提取質粒DNA是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH至中性時，因為共價閉合環(huán)狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結構，而復性的質粒DNA恢復原來構型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質粒DNA。
二、儀器及試劑
1.儀器及耗材：37℃恒溫搖床、冷凍離心機、臺式離心機、微量移液器、50 ml離心管、1.5 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。
2.試劑及配制：
LB培養(yǎng)液的配制：
酵母浸提物 5.0 g；
胰蛋白胨 10.0 g；
NaCl 10.0 g；
依次稱量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 ml）調節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。
溶液 Ⅰ（GET緩沖液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖
配制：1000 ml
1 mol/L Tris-HCl（pH8.0） 25 ml
0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 ml
20% Glucose（1.11mol/L） 45 ml
dH2O 910ml
將以上溶液混合裝瓶， 10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。
溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH ， 1% SDS
配制： 500 ml
10% SDS 50 ml
2N NaOH 50 ml
取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時間最好不超過一個月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：SDS易產生氣泡，不要劇烈攪拌。
溶液 III (醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸
配制：500 ml
醋酸鉀 147 g
冰醋酸 57.5 ml
加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至500 ml。高溫高壓滅菌后，4℃保存。
10×TE緩沖液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA
配制：1000ml
1 mol/LTris-HCl 緩沖液(pH 8.0) 100ml
500 mmol/L EDTA (pH8.0) 20 ml
加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，4℃保存。
苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。
其它試劑：TE（pH8.0）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）
三、操作步驟
1.菌體的培養(yǎng)和收獲
(1）將5～10 ml含有氨卞青霉素（AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然后接入一單菌落，并保持通氣良好，于37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉接一次，于37℃ 220 rpm振搖培養(yǎng)3～4 h。
(2）吸取培養(yǎng)的菌液1.5 ml，轉入1.5 ml的離心管中，用臺式離心機以12000 rpm離心3 min。棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。
2.質粒DNA提?。▔A裂解法）
（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。
（2）加200 ul溶液 Ⅱ，蓋緊管口，輕緩上下顛倒離心管以混合內容物。室溫靜置5 min（溶液變透明，粘稠）。
（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和10 sec，置冰上10 min (溶液出現(xiàn)白色沉淀)。
（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）。
（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一離心管。
（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。
（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺式離心機12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）。
（8）沉淀加20μl TE, 反復吹打使質粒DNA充分溶解，－20℃保存。
四、常見問題及可能原因
1.提取的質粒DNA不純：變性不充分；關鍵步驟反應時間過短；離心時間或速度不夠。
2.提取的質粒DNA呈涂布狀：操作過程中用力過猛，動作過大；操作系統(tǒng)內有污染。
3.與染色體DNA分離不全：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。
實驗三 瓊脂糖凝膠電泳
一、實驗原理
瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA 片段的常用技術。把DNA樣品加入到一塊包含電解質的多孔支持介質（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側帶有含負電荷的磷酸根殘基，因此在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質量的DNA， 也可以分離相對分子質量相同，而構型不同的DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。相對分子質量標準參照物相對可以提供一個用于確定DNA片段大小的標準。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的堿基之間，形成一種絡合物，在254～365nm波長紫外光照射下，呈桔紅色熒光，因此也可對分離的DNA進行檢測。
一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在0.2kb～50kb范圍內的DNA片段。本實驗介紹瓊脂糖凝膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在DNA片段分離中的應用方法。
二、儀器及試劑
1.儀器及耗材：
水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點樣板或parafilm、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。
2.試劑及配制：
50×TAE緩沖液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）
配制1000 ml
Tris 242 g
冰乙酸 57.1 ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。
1×TAE緩沖液的配制：
稱量20 ml的50×TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。
溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶
配制：100 ml
稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉移到棕色瓶中。室溫保存。
6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml
溴酚藍 25 mg
二甲苯青FF 25 mg
甘油 3 ml
用6×TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。-20℃保存。
其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder 、瓊脂糖、
三、操作步驟
1. 制備1％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)：稱取0.7 g（0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。
2. 膠板制備：取電泳槽內的有機玻璃內槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好，形成模子。將內槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。
3. 加樣：在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。
4. 電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60－100V，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。
(5）電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE溶液染色約20 min，再用清水漂洗10 min。
(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。
四、常見問題及注意事項
1．配瓊脂糖時應使其完全熔化后方可制膠。
2．瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時要輕緩。
3．電泳時應注意電源線路，預防觸電。
4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時應帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實驗室內使用。
5．紫外線對人體有損傷作用，開燈時間不宜太長，注意防護。
6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。
7．質粒DNA的存在形式有3種，①共價閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②開環(huán)DNA（ocDNA），此種質粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；③線狀DNA，因質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成。因此質粒DNA電泳的結果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動速度為：cccDNA > 線狀DNA > ocDNA。
實驗四 限制性內切核酸酶的酶切與鑒定
一、實驗原理
限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中最為有用，是常用的分子生物學工具酶。
限制性內切酶識別序列長度一般為4～8個呈回文序列的特異核苷酸對。一般情況下，識別序列越長，在同一DNA分子中識別位點出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性內切酶的酶切位點已被確定。例如EcoRl 酶的識別與切割序列為以下6個堿基對。
5′……GAATTC……3′
3′……CTT AAG…… 5′
EcoR I以獨特的方式識別并裂解這個順序，形成兩個5′突出末端：
和
……G AATTC……
……CTT AA G……
這些末端為互補的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由EcoR I產生的其它分子末端相連接。
限制性內切酶主要用于基因組DNA的片段化、重組DNA分子的構建與鑒定、載體中目的基因片段的分離與回收以及DNA分子物理圖譜的構建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。根據(jù)酶切反應的體積不同，可分為小量酶切反應和大量的酶切反應。小量酶切反應主要應用于質粒的酶切鑒定，體積為20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反應用于制備目的基因片段，體積為50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本實驗為EcoR I對質粒pUC18的小量酶切。 在質粒的雙鏈環(huán)狀DNA分子上有多個限制性內切核酸酶酶切位點。在用特定的限制性內切核酸酶對質粒進行酶切反應后，通?？刹捎铆傊悄z電泳進行鑒定酶切效果。
二、儀器與試劑
1.儀器：
水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、 電泳設備等。
2.試劑：
質粒pUC18、EcoR I限制性內切核酸酶、內切酶反應緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、6×上樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。
三、操作步驟
1．限制性內切酶反應一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進行。
2. 酶切反應體系（10ul）：
酶解緩沖液（10×buffer） 1 ul
限制性內切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U)
底物DNA（質粒） x ul（依質粒濃度而定）
滅菌ddH2O 加至10 ul
限制性內切酶最后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后6000 r/min，離心15s。37℃水浴消化2h。
3.酶切完畢，取5ul酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切反應效果，必須用DNA分子量標準物同時進行電泳以確定DNA片段的大小。如果酶切不完全，可繼續(xù).酶解消化反應，或加入適量酶后繼續(xù)反應。
5. 經電泳觀察酶切反應完全后，將上述反應液置65℃水浴中10～15min，中止酶切反應，將剩余酶切產物保存于?C20℃備用。
四、注意事項
1.限制性內切酶需保存于-20℃，操作時應將酶保持在冰浴中，避免長時間置于高溫中。
2. 限制性內切酶溶液通常含有50%甘油，加入反應管后，因密度較大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分搖勻。
3. 加樣時吸頭垂直進入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。
4. 酶（置于冰盒上）應最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深。
5. 酶解消化反應溫度及時間根據(jù)該酶使用說明書而定。
6. 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA計算，酶的體積應低于反應總體積的10%，以避免酶液中甘油干擾反應 。酶量過大（≥25U/ug DNA）時，有產生所謂星號活性的可能，即在識別序列以外的位點進行切割。此外，反應體系中甘油的質量分數(shù)大于12%，以及缺少NACL和存在M等情況下，都有可能出現(xiàn)星號活性。
五、相關問題
1.酶的保存
不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：
Tris-HCl （7.4―7.8）： 維持穩(wěn)定的pH范圍。
50-100mmol/L NaCl或KCl：提供一定的離子強度。
0.1mmol/L EDTA： 絡合掉能激活限制酶的鎂離子。
1mmol/L DTT： 保護酶分子上的還原性基團。
200-500ug/ml BSA： 牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質的濃度，防止蛋白質分子濃度過低而導致酶分子變性。
50%的甘油： 使酶液保存于-20℃不至凍結。
1-5 g/L的Triton-100： 這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋白質分子的表面變性作用。
2. 酶單位的定義
限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約50ul合適的反應緩沖體系中，在1h內完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），當電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時說明已作用完全，完全切割的最少酶量定為1U的酶量。
3. 限制酶的作用條件
限制酶切割DNA的反應中，酶切條件是實驗成功的重要因素，其中包括反應的溫度、時間與反應的緩沖體系，除了這些條件外，DNA的純度與濃度也會影響酶切效果，只有在正確選擇酶反應條件時才能達到**酶切效果。
（1）作用溫度
早期的酶切反應都在37℃進行，這種方法雖然簡單、統(tǒng)一，但卻不能達到每個酶的最適反應溫度。為了達到**酶切的*****根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應溫度。
（2）緩沖體系
限制酶反應的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約100mmol/L的Tris-HCl，作用是將酶反應體系的pH維持在7.5-8.5；約10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護還原性基團；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強度。由于認識的局限性，早期的限制酶反應體系僅根據(jù)其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得最適反應條件。現(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮最大的作用。
緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時以1/10的比例加入，當然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。
(3) 反應體積與時間
酶反應體積一般不宜小于20ul。因為過小的反應體積在加入各種成分時易產生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時還要考慮反應完畢進行電泳時，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。
常規(guī)的酶切反應一般控制在60min內進行，但也可以根據(jù)切割對象與所用的酶將保溫時間延長至十幾個小時。
(4) DNA的純度與濃度
除了上述酶反應條件外，影響酶切效果的最主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質時會因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結合在DNA時也會影響酶切效果。。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。
DNA純度的另一個指標是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術語稱Smear）時，可肯定系統(tǒng)中已經污染了DNA酶。
DNA樣品中含有大量RNA時可用RNA酶處理；含有結合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時都可用氯仿/異戊醇抽提；當樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質時可以通過沉淀更換一個新的緩沖體系。當然，酶切失敗時也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內切酶自身的酶活性情況。
除純度外，DNA的濃度也會影響酶切效果，一般DNA質量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質量濃度高達1.5ug/20ul時就可能發(fā)生酶切困難。
(5)終止酶切反應的方法
如果需對酶切片段進行連接或標記等操作時，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：第一種是向反應緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡合掉酶反應中所需的鎂離子。但這種方法會影響需鎂離子的后續(xù)反應。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫30min方能達到目的；極端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點是簡單并且未向體系中引入任何物質，特別適用于連續(xù)進行幾個酶切反應；熱失活法的另一個特點是不用更換體系，所以不會造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。這種方法的特點是處理條件劇烈，能使酶徹底失活（不像第一種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。
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