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實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
目 錄
實(shí)驗(yàn)一 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用方法
實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提?。瓑A裂解法
實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳
實(shí)驗(yàn)四 限制性?xún)?nèi)切核酸酶的酶切與鑒定
實(shí)驗(yàn)五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
實(shí)驗(yàn)六 動(dòng)物組織細(xì)胞基因組 DNA提取
實(shí)驗(yàn)七 DNA的定量
實(shí)驗(yàn)八 PCR基因擴(kuò)增
實(shí)驗(yàn)九 瓊脂糖凝膠電泳分離與純化目的DNA
實(shí)驗(yàn)十 DNA重組
實(shí)驗(yàn)十一 動(dòng)物組織細(xì)胞總RNA的提取
實(shí)驗(yàn)一 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用
事實(shí)證明，在科學(xué)飛速發(fā)展的今天，無(wú)論從事哪個(gè)領(lǐng)域的研究，要想突破，除了有良好的理論基礎(chǔ)外，更重要的是依賴(lài)于先進(jìn)的技術(shù)和優(yōu)良的儀器設(shè)備以及良好的研究環(huán)境。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室除了具有一般生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器設(shè)備外，還具有一些特殊用途的儀器，這些儀器一般較精密，價(jià)格昂貴。下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項(xiàng)。
一、冷凍離心機(jī)
低溫分離技術(shù)是分子生物學(xué)研究中必不可少的手段?；蚱蔚姆蛛x、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實(shí)驗(yàn)中都離不開(kāi)低溫離心技術(shù)，因此低溫冷凍離心機(jī)成為分子生物學(xué)研究中必備的重要儀器。在國(guó)內(nèi)，有多個(gè)廠家生產(chǎn)冷凍離心機(jī)，本實(shí)驗(yàn)室的高速冷凍離心機(jī)為GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式轉(zhuǎn)頭：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。極限轉(zhuǎn)速20000rpm。
1. 安裝與調(diào)試
離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地面上，應(yīng)至少距離10cm以上且具有良好的通風(fēng)環(huán)境中，周?chē)諝鈶?yīng)呈中性，且無(wú)導(dǎo)電性灰塵、易燃?xì)怏w和腐蝕性氣體，環(huán)境溫度應(yīng)在0～30℃之間，相對(duì)濕度小于80%。試轉(zhuǎn)前應(yīng)先打開(kāi)蓋門(mén)，用手盤(pán)動(dòng)轉(zhuǎn)軸，輕巧靈活，無(wú)異?，F(xiàn)象方可上所用的轉(zhuǎn)頭。轉(zhuǎn)子準(zhǔn)確到位后打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，然后用手按住門(mén)開(kāi)關(guān)，再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)后立即停止，并觀察轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)向，若逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)即為正確，機(jī)器可投入使用。
2. 操作程序
（1）插上電源，待機(jī)指示燈亮；打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)速與定時(shí)系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機(jī)器工作轉(zhuǎn)速的出廠設(shè)定，溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時(shí)離心腔的溫度。
（2）設(shè)定機(jī)器的工作參數(shù)，如工作溫度，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間，工作轉(zhuǎn)速等。
（3）將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。
（4）按控制面板的運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，離心機(jī)開(kāi)始運(yùn)轉(zhuǎn)。在預(yù)先設(shè)定的加速時(shí)間內(nèi)，其運(yùn)速升 至預(yù)先設(shè)定的值。
（5）在預(yù)先設(shè)定的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間內(nèi)（不包括減速時(shí)間），離心機(jī)開(kāi)始減速，其轉(zhuǎn)速在預(yù)先設(shè)定的減速時(shí)間內(nèi)降至零。
（6）按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉(zhuǎn)速值，這時(shí)機(jī)器已準(zhǔn)備好下一次工作。
3. 注意事項(xiàng)
（1）離心機(jī)應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線，機(jī)器不使用，要拔掉電源插頭。
（2）開(kāi)機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機(jī)腔中有無(wú)異物掉入。
（3）樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心筒離心時(shí)離心筒與樣品應(yīng)同時(shí)平衡。
（4）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機(jī)腔或造成事故。
（5）除工作溫度、運(yùn)轉(zhuǎn)速度和運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間外，不要隨意更改機(jī)器的工作參數(shù)，以免影響機(jī)器性能。轉(zhuǎn)速設(shè)定不得超過(guò)最高轉(zhuǎn)速，以確保機(jī)器安全運(yùn)轉(zhuǎn)。
（6）使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機(jī)器不運(yùn)轉(zhuǎn)，應(yīng)關(guān)機(jī)斷電，10秒鐘后重新開(kāi)機(jī)，待所設(shè)轉(zhuǎn)速顯示后，再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，機(jī)器將照常運(yùn)轉(zhuǎn)。
（7）不得在機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中或轉(zhuǎn)子未停穩(wěn)的情況下打開(kāi)蓋門(mén)，以免發(fā)生事故。
（8）每次操作完畢應(yīng)做好使用情況記錄，并定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行檢修。
二、電泳儀
電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究不可缺少的重要手段。電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳大類(lèi)，自由界面電泳不需支持物，如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類(lèi)電泳目前已很少使用。區(qū)帶電泳需用各種類(lèi)型的物質(zhì)作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠―G薄層等，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用電泳法可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析，或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行組份分析或單個(gè)組份提取制備。下面以DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）為例介紹其使用方法。
1.使用方法
（1）按電源開(kāi)關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀…”等字樣后，同時(shí)系統(tǒng)初始化，蜂鳴4聲，設(shè)置常設(shè)置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)，見(jiàn)圖一：
U: 0V U＝ 100V ｜ Mode： STD
I: 0mA I ＝ 50mA ｜
P: 0W P＝ 50W ｜
T: 00:00 T＝ 01:00 ｜
其中:左側(cè)大寫(xiě)U: I: P: T: 為電泳時(shí)實(shí)際值；中間部分顯示程序的常設(shè)值（預(yù)置值）。Mode(模式)：STD(標(biāo)準(zhǔn))；TIME(定時(shí))；VH（伏時(shí)）；STEP（分步）
（2）設(shè)置工作程序。用鍵盤(pán)輸入新的工作程序。例如，要求工作電壓U＝1000V，電流I限制在200mA以?xún)?nèi)，功率W限制在100W以?xún)?nèi)，時(shí)間T為3小時(shí)20分，并且到時(shí)間自動(dòng)關(guān)掉輸出。則操作步驟如下：
①按“模式”鍵，將工作模式由標(biāo)準(zhǔn)（STD）轉(zhuǎn)為定時(shí)（TIME）
模式。每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變： STD?TIME?VH?STEP?STD。
②先設(shè)置電壓U，按“選擇”鍵，先將其反顯，然后輸入數(shù)字鍵即可設(shè)置該參數(shù)的數(shù)值。按數(shù)字1000,則電壓即設(shè)置完成。
③設(shè)置電流I，按“選擇”鍵，先使I反顯，然后輸入數(shù)字200。
④設(shè)置功率P，按“選擇”鍵，先使P反顯，然后輸入數(shù)字100。
⑤設(shè)置時(shí)間T，按“選擇”鍵，先使T反顯，然后輸入數(shù)字320。如果輸入錯(cuò)誤，可以按“清除”鍵，再重新輸入。
⑥確認(rèn)各參數(shù)無(wú)誤后，按“啟動(dòng)”鍵，啟動(dòng)電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start! 并蜂鳴4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，注意安全。之后逐漸將輸出電壓加至設(shè)置值。同時(shí)在狀態(tài)欄中顯示“Run”，并有兩個(gè)不斷閃爍的高壓符號(hào)，表示端口已有電壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實(shí)際的工作時(shí)間（精確到秒）。
⑦每次啟動(dòng)輸出時(shí)，儀器自動(dòng)將此時(shí)的設(shè)置數(shù)值存入“MO”號(hào)存儲(chǔ)單元。以后需要調(diào)用時(shí)可以按“讀取”鍵，再按“0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設(shè)置的工作程序取出執(zhí)行。
⑧電泳結(jié)束，儀器顯示：“END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時(shí)按任一鍵可止鳴。
2.注意事項(xiàng)
(1)U、I、P三個(gè)參數(shù)的有效輸入范圍是：U：5～3000V；I： 4～400mA；P：4～400W.
(2)一般情況下，當(dāng)No Load！時(shí)，首先應(yīng)關(guān)機(jī)檢查電極導(dǎo)線與電泳槽之間是否有接觸不良的地方，可以用萬(wàn)用表的歐姆檔逐段測(cè)量。
(3)如果輸出端接多個(gè)電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時(shí)應(yīng)選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。
(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進(jìn)風(fēng)通道。嚴(yán)禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進(jìn)儀器內(nèi)部。
(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應(yīng)不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險(xiǎn)。
(6）長(zhǎng)期不用儀器，應(yīng)放置在干燥通風(fēng)的清潔環(huán)境中保存。
三、分析天平
分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類(lèi)很多，有普通分析天平、半自動(dòng)/全自動(dòng)電光分析天平及電子分析天平等。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)備用的是自動(dòng)化程度較高的電子分析天平。下面介紹電子分析天平 PL203/01型和AL104/01型 (METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密電子天平：最大稱(chēng)量210g；實(shí)際分度值0.001g；AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱(chēng)量110g；實(shí)際分度值0.0001g
1. 使用方法
（1）檢查并調(diào)整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配（使用配置的穩(wěn)壓器），按天平儀器要求通電預(yù)熱至所需時(shí)間30min 。
（2）打開(kāi)天平開(kāi)關(guān)“on”，天平則自動(dòng)進(jìn)行靈敏度及零點(diǎn)調(diào)節(jié)。待顯示屏上所有字段短時(shí)點(diǎn)亮，天平回零時(shí)，可進(jìn)行正式稱(chēng)量。
（3）稱(chēng)量時(shí)將潔凈稱(chēng)量瓶或稱(chēng)量紙置于稱(chēng)盤(pán)上，關(guān)上側(cè)門(mén)，天平將顯示該重量，點(diǎn)擊“?O/T?”鍵自動(dòng)校對(duì)零，然后逐漸加入待稱(chēng)物質(zhì)，直至所需重量為止。
（4）稱(chēng)量結(jié)束應(yīng)及時(shí)除去稱(chēng)量瓶（紙），關(guān)上側(cè)門(mén)，切斷電源，并做好使用情況登記。
2. 注意事項(xiàng)
（1）天平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)水泥臺(tái)或木臺(tái)上，室內(nèi)要求清潔、干燥，同時(shí)應(yīng)避免光線直接照射到天平上。
（2）稱(chēng)量時(shí)應(yīng)從側(cè)門(mén)取放物質(zhì)，讀數(shù)時(shí)應(yīng)關(guān)閉箱門(mén)以免空氣流動(dòng)引起天平擺動(dòng)。
（3）揮發(fā)性、腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿類(lèi)物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱(chēng)量瓶?jī)?nèi)稱(chēng)量，防止腐蝕天平。
（4）電子分析天平若長(zhǎng)時(shí)間不使用，則應(yīng)定時(shí)通電預(yù)熱，每周一次，每次預(yù)熱2h，以確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。
四、分光光度計(jì)
不同物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)入射的吸收程度各不相同，從而形成各具特征的吸收光譜 。根據(jù)這一原理，應(yīng)用比色法可以對(duì)某些有色物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。但由于比色法僅限于可見(jiàn)光區(qū)，而且精度低，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足高精度微量分析的要求。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，分析儀器也不斷地更新?lián)Q代，人們引進(jìn)了分光光度法的概念，分光光度計(jì)隨之應(yīng)用。分光光度計(jì)由光源、單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成，它不僅適應(yīng)于可見(jiàn)光區(qū)，同時(shí)還擴(kuò)展至紫外光區(qū)及紅外光區(qū)。光密度（OD）是許多溶液中的溶質(zhì)定量的指標(biāo)之一，通過(guò)所產(chǎn)生的單色光而測(cè)定某一溶液對(duì)該單色光的吸收值。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸溶液定量和純度的初步判斷。下面介紹紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)GeneQantTM Pro（Amersham）的使用方法。該儀器除了能檢測(cè)核酸樣品濃度外，還可進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度以及細(xì)胞培養(yǎng)液濃度的測(cè)定，能檢測(cè)低至幾微升樣品（70μl和5～7μl），樣品無(wú)需稀釋?zhuān)瑴y(cè)量后還可全部回收。
使用方法
(1）打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)（ON），等待數(shù)秒鐘，顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù)，如本機(jī)型號(hào)、當(dāng)前日期等，這些數(shù)據(jù)可以重新設(shè)置，當(dāng)出現(xiàn)“instrument Ready”即可進(jìn)入下一程序。
(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測(cè)base sep 、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲檢測(cè)DNA， 按DNA鍵，即進(jìn)入DNA檢測(cè)程序。在顯示屏上：
Pathlengh 10mm
Units μg/μl
Use 320nm NO
Dilution Faotor 1
Insert reference,
以上為儀器預(yù)設(shè)置的參考數(shù)據(jù)，若按“enter”鍵，和“select”鍵可以將以上的參數(shù)進(jìn)行重新設(shè)定。
(3）取石英樣品杯70μl或5～7μl ，容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中，然后放入儀器上的樣品槽中，放入時(shí)注意樣品杯的光學(xué)面朝前方。
(4)按“set ref”鍵，進(jìn)行空白測(cè)試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均“0.000”并提示插入樣品“Insert sample ”。將樣品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同樣吸入待測(cè)樣品，放入樣品槽中進(jìn)行測(cè)定。
(5）一個(gè)樣品測(cè)定完畢，按“stop”鍵，返回“Instrument Ready”。
(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。由于樣品杯十分昂貴，使用時(shí)要小心操作。不能用手指拿樣品杯的光學(xué)面，用后要及時(shí)洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過(guò)15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。
五、數(shù)字式酸度計(jì)
酸度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室配置溶液必備的儀器。本實(shí)驗(yàn)室的酸度計(jì)為臺(tái)式微電腦酸堿度計(jì)和溫度計(jì)（Hanna）,測(cè)量pH范圍為0.00～14.00pH；溫度為0.0～100.0℃；
1. 使用方法
（1）將pH電極和溫度探頭與主機(jī)連接，主機(jī)與電源連接。
（2）取出電極保護(hù)套，如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn)，這是電極常見(jiàn)現(xiàn)象，浸入水后就會(huì)消逝。如果薄膜玻璃或透析膜發(fā)干，可在HI170300電極保存液中浸泡1小時(shí)。
（3）pH校準(zhǔn)。將pH電極和溫度探棒浸泡在所選的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH6.86、7.01），緩沖液值可通過(guò)“D℃”或“?℃”鍵來(lái)調(diào)節(jié)。按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號(hào)及“7.01”數(shù)據(jù)。當(dāng)讀數(shù)不穩(wěn)定時(shí)，屏幕會(huì)顯示“NOTREADY”；當(dāng)讀數(shù)穩(wěn)定時(shí)，屏幕會(huì)顯示“READY”和“CFM”，按“CFM”鍵確認(rèn)校準(zhǔn)值。確認(rèn)第一校準(zhǔn)點(diǎn)后，將pH電極與溫度探棒浸泡在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號(hào)及“4.01”數(shù)據(jù)。按“CFM”鍵確認(rèn)校正值。
（4）pH測(cè)量。校準(zhǔn)完畢后，儀器自動(dòng)進(jìn)入pH測(cè)量狀態(tài)，將電極與溫度探棒浸泡在待測(cè)溶液約4cm，停幾分鐘讓電極讀數(shù)穩(wěn)定。
2. 注意事項(xiàng)
（1）由于pH211酸度計(jì)內(nèi)裝有可充電電池，在剛購(gòu)買(mǎi)或長(zhǎng)時(shí)間放置后，再使用時(shí)，通電校正測(cè)量完畢后，可將電源繼續(xù)還插入電源插座，只需關(guān)閉開(kāi)關(guān)，這樣可以保證電池充電，是校正值得以?xún)?chǔ)存，下次測(cè)量時(shí)無(wú)須校正即可進(jìn)入精確測(cè)量。
（2）不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。如果讀數(shù)偏差太大（±1pH），則是由于沒(méi)有校正或電極變干。為避免電極受損，在關(guān)機(jī)前要將pH電極從溶液中拿出。當(dāng)處于關(guān)機(jī)狀態(tài)時(shí)，在電極浸入電極保存液前，電極要與機(jī)器分開(kāi)。
（3）如儀器已測(cè)過(guò)幾種不同的樣品溶液，請(qǐng)用自來(lái)水清洗，或在插入樣品溶液前，用待測(cè)樣品清洗電極。
（4）溫度會(huì)影響pH的讀數(shù)，為測(cè)量準(zhǔn)確的pH值，溫度要在適合的范圍內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)溫度補(bǔ)償，用HI7669/2W溫度探棒浸入樣品中，緊靠電極并停幾分鐘，如果被測(cè)溶液的溫度已知或測(cè)量是在相同溫度下進(jìn)行，只需動(dòng)手補(bǔ)償，那么此時(shí)溫度探棒是不用連接，屏幕上會(huì)顯示溫度讀數(shù)伴有℃信號(hào)閃爍。溫度可通過(guò)“?℃”或“D℃”來(lái)調(diào)節(jié)。
六、PCR儀
PCR儀，也稱(chēng)DNA熱循環(huán)儀、基因擴(kuò)增儀，它是使一對(duì)寡核苷酸引物結(jié)合到正負(fù)DNA鏈上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬(wàn)倍的靶序列DNA片段，它的每一循環(huán)包括在三種不同溫度進(jìn)行DNA變性、引物復(fù)性、DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)的三個(gè)過(guò)程。
PCR儀主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等許多領(lǐng)域，如基因分析、序列分析、進(jìn)化分析、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)等等。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，PCR擴(kuò)增技術(shù)也得到普及推廣應(yīng)用，因此了解PCR儀的性能，熟練掌握儀器的正確使用方法及使用過(guò)程中的注意事項(xiàng)，將是十分必要的。
現(xiàn)介紹PCR 擴(kuò)增儀（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事項(xiàng)。
1. 使用方法
(1）接通電源開(kāi)關(guān)，儀器進(jìn)入準(zhǔn)備狀態(tài)；在顯示屏上記錄了當(dāng)前儀器的溫度和蓋子（Lid）的溫度。若儀器正在運(yùn)行時(shí)，須按“ B ”鍵（start/stop），才能退出運(yùn)行并返回準(zhǔn)備狀態(tài)。
(2）編寫(xiě)程序段。在準(zhǔn)備狀態(tài)下按“ C ”鍵(programs)進(jìn)入編程狀態(tài)，選定一程序號(hào)，然后按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按 “A”(list)鍵后，選一文件號(hào)（empty program）；再按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按“ABC”鍵，進(jìn)入下一程序，用上下左右鍵號(hào)選擇一個(gè)字母（A、B、C、D、…），然后按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按“name ok”鍵，完成文件命名。
(3）設(shè)定蓋子的溫度?！?/span>lid temp： ℃”，蓋子的溫度一般比變性溫度要高10℃，例如變性溫度是95℃，那么蓋子的溫度就要設(shè)定為105℃。待蓋子預(yù)熱后按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序。
(4）設(shè)定變性溫度、變性時(shí)間、延伸溫度、延伸時(shí)間、退火溫度、退火時(shí)間及循環(huán)總數(shù)等參數(shù)。從第一步依次按“enter”鍵進(jìn)入，用四個(gè)移位鍵移動(dòng)設(shè)定位置。先設(shè)定溫度，后設(shè)定時(shí)間，全部參數(shù)設(shè)置完后，按“pgm ok”鍵，所設(shè)定的程序自動(dòng)被保存。
(5）運(yùn)行程序。檢查設(shè)定是否正確， 按“start”鍵，選擇設(shè)定好的程序，開(kāi)始運(yùn)行。顯示屏上可觀察到系統(tǒng)運(yùn)行的情況，按“Stop”可停止運(yùn)行。
七、凝膠成像系統(tǒng)
本系統(tǒng)屬全自動(dòng)電腦控制影像分析系統(tǒng)，主要拍攝核酸的agarose電泳膠片，及蛋白質(zhì)的acrylamide電泳膠片。在與markers比較后，可精確計(jì)算樣本的分子量，對(duì)核酸電泳也可準(zhǔn)確定量，是分子生物學(xué)及生化蛋白試驗(yàn)的重要檢測(cè)工具。本系統(tǒng)包括暗箱，紫外透射儀，攝像頭，變焦鏡，電腦以及專(zhuān)業(yè)凝膠圖象采集及分析.軟件（3.3版）。該軟件提供對(duì)電泳凝膠、斑點(diǎn)測(cè)量、PCR密度的定量分析等。此外，還提供圖像采集、標(biāo)注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā)送到Word、Excel、圖像處理等功能。
1.使用方法
(1) 打開(kāi)電腦，啟動(dòng)凝膠分析軟件，進(jìn)入用戶界面。
（2）打開(kāi)采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開(kāi)關(guān)，放入凝膠，打開(kāi)紫外光源或白光光源，將采集裝置與電腦上采集卡相連，然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖像采集”按鈕，出現(xiàn)圖像窗口：“開(kāi)始采集”、“停止采集”、“采集圖像”等。如果圖像不清晰，可以調(diào)節(jié)暗箱上的變焦鏡，使之清晰?？芍苯訉D像保存起來(lái)，也可通過(guò)“圖像處理”對(duì)圖像進(jìn)行旋轉(zhuǎn)、裁剪、濾波、調(diào)節(jié)對(duì)比度……方面的處理。
(3)對(duì)讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)。在“功能選擇”菜單中選擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具，將出現(xiàn)泳道分析工具欄，并在“圖像顯示”子窗口中出現(xiàn)一個(gè)紅色的矩形框。還可進(jìn)入“條帶分析”系統(tǒng)，對(duì)條帶 進(jìn)行編號(hào)，對(duì)二條以上的條帶進(jìn)行比較。
（4）采集圖像結(jié)束后，關(guān)閉暗箱電源開(kāi)關(guān)，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。
八、空氣恒溫?fù)u床
搖床（振蕩器）為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)設(shè)備。SHK-99-Ⅱ型臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度±0.5℃；時(shí)間范圍：1分鐘～99小時(shí)59分鐘；轉(zhuǎn)速范圍：60RPM～250RPM。
1.使用方法
(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：
RPM Temp Time
1 000 00.0 00:00
屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“2”，“Temp”表示溫度，“RPM”表示每分鐘轉(zhuǎn)速，“Time”表示時(shí)間，不設(shè)定時(shí)可自動(dòng)累計(jì)時(shí)間一直運(yùn)行?！?/span>Temp”、“RPM”、“Time”的值隨時(shí)可以修改，隨時(shí)按新值運(yùn)行。
(2）工作程序設(shè)置。按“F1”鍵，進(jìn)入設(shè)置狀態(tài)?？稍谒俣龋瑴囟?，時(shí)間，運(yùn)行等四部分之間切換。在每一部分按“F2”鍵輸入數(shù)據(jù)，輸入完十位數(shù)據(jù)，再輸入個(gè)位數(shù)據(jù)，按“F2”鍵，再按“F2”鍵，到小數(shù)位，再按“F2”鍵，又到十位，以此循環(huán)。
(3）再按“F1”鍵，轉(zhuǎn)回運(yùn)行狀態(tài)，按“Start”鍵，電機(jī)開(kāi)始運(yùn)行，時(shí)間開(kāi)始計(jì)時(shí)。
(4）按“End”鍵，結(jié)束系統(tǒng)運(yùn)行。
2. 注意事項(xiàng)
（1）打開(kāi)電源，系統(tǒng)開(kāi)始自檢，等待LCD屏幕出現(xiàn)“WELCOME”字樣，系統(tǒng)自檢完畢，可以進(jìn)行第2步參數(shù)設(shè)置。若屏幕出現(xiàn)：a.“TEMP ERROR”，表示溫度檢測(cè)線路有錯(cuò)誤；b.“MOTOR ERROR”，表示電機(jī)部分有錯(cuò)誤。
（2）運(yùn)行過(guò)程可以打開(kāi)箱蓋，這樣電機(jī)不運(yùn)行，時(shí)間也停止，蓋上蓋接著運(yùn)行。
（3）工作完畢，關(guān)閉電源。關(guān)機(jī)后，要等一段時(shí)間再開(kāi)機(jī)。
九、水的凈化裝置
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)水的純度要求越來(lái)越高，一般蒸餾水常常難以滿足實(shí)驗(yàn)要求，大多要求要進(jìn)行第二次蒸餾（雙蒸水），它可以去除水中的大部分有機(jī)雜質(zhì)，但制作時(shí)間較長(zhǎng)，而且無(wú)機(jī)雜質(zhì)還是很多。許多實(shí)驗(yàn)還需要去離子水，這就需要陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行處理。目前，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都使用高質(zhì)量的超純水。如美國(guó)微孔濾膜公司的Milli-Q超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學(xué)科領(lǐng)域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測(cè)序、酶反應(yīng)、組織和細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)。下面介紹RO-MB壁掛式反滲透高純水機(jī)性能及使用方法。RO-MB反滲透高純水機(jī)（杭州永潔達(dá)）產(chǎn)水量（25℃）10L/H；產(chǎn)水水質(zhì)：RO純水：<10μs/cm，高純水：>15MΩ.cm；可用自來(lái)水制成普通實(shí)驗(yàn)用水和高純水，同時(shí)滿足不同水質(zhì)要求。在線電導(dǎo)率儀對(duì)產(chǎn)水水質(zhì)連續(xù)檢測(cè)，可保證產(chǎn)水質(zhì)量。
1. 使用方法
(1)準(zhǔn)備：先檢測(cè)與純水機(jī)相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開(kāi)原水閥門(mén)。供電電源是否正常，檢查按鈕是否在關(guān)閉狀態(tài)（按鈕彈出狀態(tài)）。將電源插頭插入帶有接地線的220V電源插座上。
(2）開(kāi)機(jī)：依次按下電源開(kāi)關(guān)，泵開(kāi)關(guān)，純水機(jī)啟動(dòng)產(chǎn)水，同時(shí)廢水排出，指示燈亮起，并處于自動(dòng)運(yùn)行狀態(tài)。
(3）取純水：若打開(kāi)RO純水或高純水出口閥門(mén)，則可獲得相應(yīng)水質(zhì)的純水。當(dāng)高純水出口閥門(mén)打開(kāi)時(shí)，檢測(cè)儀表顯示高純水電導(dǎo)率或電阻值。為了獲得高質(zhì)量的高純水，可以先放掉一杯水后再取新鮮水。
(4）關(guān)機(jī)：不用時(shí)可關(guān)閉個(gè)按鈕停機(jī)，自來(lái)水進(jìn)水閥門(mén)不必關(guān)閉，這時(shí)機(jī)子內(nèi)部的進(jìn)水電磁閥已自動(dòng)切斷水路。只要管路閥門(mén)不漏，也可使機(jī)子保持自動(dòng)待機(jī)狀態(tài)。
2.注意事項(xiàng)
（1）純水機(jī)的正常使用環(huán)境溫度為15～35℃，產(chǎn)水量會(huì)隨溫度降低而下降，冬季保養(yǎng)溫度不低于5℃。
（2）預(yù)處理濾芯一般三至六個(gè)月更換一次，實(shí)際使用壽命與自來(lái)水水質(zhì)、總過(guò)濾量等有關(guān)。
（3）混床濾芯產(chǎn)高純水約1～3噸，約二至四個(gè)月更換一次，實(shí)際使用壽命與自來(lái)水水質(zhì)、水中含鹽量、總用水量等有關(guān)。設(shè)備停運(yùn)時(shí)間超過(guò)2天。必須注意定期沖洗維護(hù)。夏季宜每天開(kāi)機(jī)30分鐘沖洗一次，冬季每隔2～3天開(kāi)機(jī)沖洗一次。
（4）使用過(guò)程若發(fā)現(xiàn)停機(jī)后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī)，此為管路漏水引起，需及時(shí)打開(kāi)機(jī)箱加以解決。若每隔半小時(shí)以上啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī)，乃屬正?，F(xiàn)象，有利于沖洗和保護(hù)反滲透膜元件，避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積，尤其高溫季節(jié)。
十、消毒設(shè)備
細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)以及核酸等有關(guān)實(shí)驗(yàn)所用的試劑、器皿及實(shí)驗(yàn)用具，應(yīng)嚴(yán)格滅菌，有的實(shí)驗(yàn)還要求沒(méi)有核酸酶的污染，故應(yīng)將實(shí)驗(yàn)器械，試劑等進(jìn)行高壓消毒。對(duì)于經(jīng)過(guò)導(dǎo)入DNA重組分子的菌株，操作后必須進(jìn)行嚴(yán)格的高壓消毒滅活處理。
大批實(shí)驗(yàn)物品、試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進(jìn)行消毒。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。所有的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)的操作，都應(yīng)在紫外線消毒后的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
下面介紹立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40BI）的使用方法。
1.使用方法
（1）開(kāi)蓋：轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使鍋蓋離開(kāi)密封圈。
（2）通電：連接自動(dòng)進(jìn)水裝置。接通電源，將控制面板上電源開(kāi)關(guān)按至ON處，若水位低（LOW）紅燈亮，蒸發(fā)鍋內(nèi)屬斷水狀態(tài)；缺水（LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。
（3）加水：打開(kāi)水源，水位達(dá)到低水位，控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅，加熱（1-綠燈）亮，繼續(xù)加水至高水位（HIGH）綠燈亮，自動(dòng)停止加水。
（4）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過(guò)200mm×100mm×100mm為宜，各包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。
（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。
（6）設(shè)定溫度：通電后數(shù)顯窗燈亮，上層為紅色，顯示溫度，下層為綠色，設(shè)定溫度和時(shí)間。先按控制面板上確認(rèn)鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進(jìn)入溫度設(shè)定狀態(tài)。按一次移位鍵 所指相應(yīng)位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行（單項(xiàng)循環(huán)）移位。按△增加鍵或??減少鍵，進(jìn)行所需溫度設(shè)定。設(shè)定完畢，按二次確認(rèn)鍵，進(jìn)行溫度確認(rèn)。
（7）設(shè)定時(shí)間：按一次確認(rèn)鍵，將溫度設(shè)定切換成時(shí)間設(shè)定；再按一次移位鍵，所指相應(yīng)位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行移位；按增加鍵或減少鍵，進(jìn)行所需時(shí)間設(shè)定。設(shè)定完畢，按二次確認(rèn)鍵，進(jìn)行時(shí)間設(shè)定確認(rèn)。時(shí)間采用倒計(jì)時(shí)，當(dāng)滅菌鍋內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度，定時(shí)器開(kāi)始倒計(jì)時(shí)。
（8）滅菌：在加熱初，將下排汽閥打開(kāi)至垂直位置；下排汽閥待蒸汽冒出時(shí)，壓力表顯示指示為100℃時(shí)，將下排汽閥推向水平關(guān)閉位置；留有微量蒸汽逸出，以控制總汽流量的15%為宜。使用最高滅菌溫度為124℃～126℃，壓力在0.145Mpa～0.165Mpa范圍內(nèi)屬于安全閥設(shè)定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動(dòng)泄壓，并開(kāi)始計(jì)數(shù)滅菌所需時(shí)間。滅菌完成，電控裝置將自動(dòng)關(guān)閉加熱系統(tǒng)，伴有蜂鳴提醒；并將保溫時(shí)間切換成END顯示；此時(shí)，將控制面板上電源開(kāi)關(guān)按至OFF處；關(guān)閉電源，停止加熱待其冷卻。
（9）干燥：物品滅菌后需要迅速干燥，須打開(kāi)放汽閥和下排汽閥，將滅菌器內(nèi)的蒸汽迅速排出，使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。
（10）將蓋開(kāi)啟，取出已滅菌物品。關(guān)閉水源，打開(kāi)下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。
2.注意事項(xiàng)
（1）堆放滅菌物品時(shí)，嚴(yán)禁堵塞安全閥的出汽孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。
（2）滅菌液體時(shí)，應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過(guò)3/4體積為好，瓶口選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，特別注意，在滅菌液體結(jié)束時(shí)不準(zhǔn)立即釋放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。
（3）對(duì)不同類(lèi)型，不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免顧此失彼，造成損失。
實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提?。瓑A裂解法
一、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌質(zhì)粒是一類(lèi)雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。
一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類(lèi)型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。
堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤(pán)繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，因?yàn)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來(lái)構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。
二、儀器及試劑
1.儀器及耗材：37℃恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器、50 ml離心管、1.5 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。
2.試劑及配制：
LB培養(yǎng)液的配制：
酵母浸提物 5.0 g；
胰蛋白胨 10.0 g；
NaCl 10.0 g；
依次稱(chēng)量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 ml）調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。
溶液 Ⅰ（GET緩沖液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖
配制：1000 ml
1 mol/L Tris-HCl（pH8.0） 25 ml
0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 ml
20% Glucose（1.11mol/L） 45 ml
dH2O 910ml
將以上溶液混合裝瓶， 10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。
溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH ， 1% SDS
配制： 500 ml
10% SDS 50 ml
2N NaOH 50 ml
取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時(shí)間最好不超過(guò)一個(gè)月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢琛?/span>
溶液 III (醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸
配制：500 ml
醋酸鉀 147 g
冰醋酸 57.5 ml
加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至500 ml。高溫高壓滅菌后，4℃保存。
10×TE緩沖液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA
配制：1000ml
1 mol/LTris-HCl 緩沖液(pH 8.0) 100ml
500 mmol/L EDTA (pH8.0) 20 ml
加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，4℃保存。
苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。
其它試劑：TE（pH8.0）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無(wú)水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）
三、操作步驟
1.菌體的培養(yǎng)和收獲
(1）將5～10 ml含有氨卞青霉素（AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然后接入一單菌落，并保持通氣良好，于37℃ 220 rpm振搖過(guò)夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)接一次，于37℃ 220 rpm振搖培養(yǎng)3～4 h。
(2）吸取培養(yǎng)的菌液1.5 ml，轉(zhuǎn)入1.5 ml的離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm離心3 min。棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。
2.質(zhì)粒DNA提?。▔A裂解法）
（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細(xì)菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。
（2）加200 ul溶液 Ⅱ，蓋緊管口，輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。室溫靜置5 min（溶液變透明，粘稠）。
（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和10 sec，置冰上10 min (溶液出現(xiàn)白色沉淀)。
（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）。
（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一離心管。
（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。
（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺(tái)式離心機(jī)12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）。
（8）沉淀加20μl TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒DNA充分溶解，－20℃保存。
四、常見(jiàn)問(wèn)題及可能原因
1.提取的質(zhì)粒DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時(shí)間過(guò)短；離心時(shí)間或速度不夠。
2.提取的質(zhì)粒DNA呈涂布狀：操作過(guò)程中用力過(guò)猛，動(dòng)作過(guò)大；操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。
3.與染色體DNA分離不全：變性過(guò)程不完全；試劑配制有問(wèn)題（成分，濃度或pH）。
實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳
一、實(shí)驗(yàn)原理
瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA 片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場(chǎng)上。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來(lái)使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA， 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的DNA分子。在電泳過(guò)程中可以通過(guò)示蹤染料或相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相對(duì)可以提供一個(gè)用于確定DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的堿基之間，形成一種絡(luò)合物，在254～365nm波長(zhǎng)紫外光照射下，呈桔紅色熒光，因此也可對(duì)分離的DNA進(jìn)行檢測(cè)。
一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在0.2kb～50kb范圍內(nèi)的DNA片段。本實(shí)驗(yàn)介紹瓊脂糖凝膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在DNA片段分離中的應(yīng)用方法。
二、儀器及試劑
1.儀器及耗材：
水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點(diǎn)樣板或parafilm、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。
2.試劑及配制：
50×TAE緩沖液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）
配制1000 ml
Tris 242 g
冰乙酸 57.1 ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。
1×TAE緩沖液的配制：
稱(chēng)量20 ml的50×TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。
溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶
配制：100 ml
稱(chēng)取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。
6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml
溴酚藍(lán) 25 mg
二甲苯青FF 25 mg
甘油 3 ml
用6×TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。-20℃保存。
其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder 、瓊脂糖、
三、操作步驟
1. 制備1％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)：稱(chēng)取0.7 g（0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。
2. 膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開(kāi)，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1×TAE電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板為止。
3. 加樣：在點(diǎn)樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周?chē)哪z面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。
4. 電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60－100V，樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí)，停止電泳。
(5）電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE溶液染色約20 min，再用清水漂洗10 min。
(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。
四、常見(jiàn)問(wèn)題及注意事項(xiàng)
1．配瓊脂糖時(shí)應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。
2．瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時(shí)要輕緩。
3．電泳時(shí)應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。
4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時(shí)應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。
5．紫外線對(duì)人體有損傷作用，開(kāi)燈時(shí)間不宜太長(zhǎng)，注意防護(hù)。
6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過(guò)多；電壓太高；凝膠中有氣泡。
7．質(zhì)粒DNA的存在形式有3種，①共價(jià)閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；③線狀DNA，因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動(dòng)速度為：cccDNA > 線狀DNA > ocDNA。
實(shí)驗(yàn)四 限制性?xún)?nèi)切核酸酶的酶切與鑒定
一、實(shí)驗(yàn)原理
限制性?xún)?nèi)切酶是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類(lèi)。其中Ⅱ類(lèi)酶在分子克隆和基因操作中最為有用，是常用的分子生物學(xué)工具酶。
限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度一般為4～8個(gè)呈回文序列的特異核苷酸對(duì)。一般情況下，識(shí)別序列越長(zhǎng)，在同一DNA分子中識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)已被確定。例如EcoRl 酶的識(shí)別與切割序列為以下6個(gè)堿基對(duì)。
5′……GAATTC……3′
3′……CTT AAG…… 5′
EcoR I以獨(dú)特的方式識(shí)別并裂解這個(gè)順序，形成兩個(gè)5′突出末端：
和
……G AATTC……
……CTT AA G……
這些末端為互補(bǔ)的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由EcoR I產(chǎn)生的其它分子末端相連接。
限制性?xún)?nèi)切酶主要用于基因組DNA的片段化、重組DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的基因片段的分離與回收以及DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同，可分為小量酶切反應(yīng)和大量的酶切反應(yīng)。小量酶切反應(yīng)主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定，體積為20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反應(yīng)用于制備目的基因片段，體積為50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本實(shí)驗(yàn)為EcoR I對(duì)質(zhì)粒pUC18的小量酶切。 在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀DNA分子上有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在用特定的限制性?xún)?nèi)切核酸酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)后，通?？刹捎铆傊悄z電泳進(jìn)行鑒定酶切效果。
二、儀器與試劑
1.儀器：
水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、 電泳設(shè)備等。
2.試劑：
質(zhì)粒pUC18、EcoR I限制性?xún)?nèi)切核酸酶、內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、6×上樣緩沖液、溴化乙啶染液、無(wú)菌水等。
三、操作步驟
1．限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進(jìn)行。
2. 酶切反應(yīng)體系（10ul）：
酶解緩沖液（10×buffer） 1 ul
限制性?xún)?nèi)切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U)
底物DNA（質(zhì)粒） x ul（依質(zhì)粒濃度而定）
滅菌ddH2O 加至10 ul
限制性?xún)?nèi)切酶最后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后6000 r/min，離心15s。37℃水浴消化2h。
3.酶切完畢，取5ul酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切反應(yīng)效果，必須用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)進(jìn)行電泳以確定DNA片段的大小。如果酶切不完全，可繼續(xù).酶解消化反應(yīng)，或加入適量酶后繼續(xù)反應(yīng)。
5. 經(jīng)電泳觀察酶切反應(yīng)完全后，將上述反應(yīng)液置65℃水浴中10～15min，中止酶切反應(yīng)，將剩余酶切產(chǎn)物保存于?C20℃備用。
四、注意事項(xiàng)
1.限制性?xún)?nèi)切酶需保存于-20℃，操作時(shí)應(yīng)將酶保持在冰浴中，避免長(zhǎng)時(shí)間置于高溫中。
2. 限制性?xún)?nèi)切酶溶液通常含有50%甘油，加入反應(yīng)管后，因密度較大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分搖勻。
3. 加樣時(shí)吸頭垂直進(jìn)入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個(gè)吸頭，同時(shí)在已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加，避免污染。
4. 酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過(guò)深。
5. 酶解消化反應(yīng)溫度及時(shí)間根據(jù)該酶使用說(shuō)明書(shū)而定。
6. 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA計(jì)算，酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積的10%，以避免酶液中甘油干擾反應(yīng) 。酶量過(guò)大（≥25U/ug DNA）時(shí)，有產(chǎn)生所謂星號(hào)活性的可能，即在識(shí)別序列以外的位點(diǎn)進(jìn)行切割。此外，反應(yīng)體系中甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于12%，以及缺少NACL和存在M等情況下，都有可能出現(xiàn)星號(hào)活性。
五、相關(guān)問(wèn)題
1.酶的保存
不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長(zhǎng)時(shí)間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：
Tris-HCl （7.4―7.8）： 維持穩(wěn)定的pH范圍。
50-100mmol/L NaCl或KCl：提供一定的離子強(qiáng)度。
0.1mmol/L EDTA： 絡(luò)合掉能激活限制酶的鎂離子。
1mmol/L DTT： 保護(hù)酶分子上的還原性基團(tuán)。
200-500ug/ml BSA： 牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止蛋白質(zhì)分子濃度過(guò)低而導(dǎo)致酶分子變性。
50%的甘油： 使酶液保存于-20℃不至凍結(jié)。
1-5 g/L的Triton-100： 這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋白質(zhì)分子的表面變性作用。
2. 酶單位的定義
限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約50ul合適的反應(yīng)緩沖體系中，在1h內(nèi)完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），當(dāng)電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時(shí)說(shuō)明已作用完全，完全切割的最少酶量定為1U的酶量。
3. 限制酶的作用條件
限制酶切割DNA的反應(yīng)中，酶切條件是實(shí)驗(yàn)成功的重要因素，其中包括反應(yīng)的溫度、時(shí)間與反應(yīng)的緩沖體系，除了這些條件外，DNA的純度與濃度也會(huì)影響酶切效果，只有在正確選擇酶反應(yīng)條件時(shí)才能達(dá)到**酶切效果。
（1）作用溫度
早期的酶切反應(yīng)都在37℃進(jìn)行，這種方法雖然簡(jiǎn)單、統(tǒng)一，但卻不能達(dá)到每個(gè)酶的最適反應(yīng)溫度。為了達(dá)到**酶切的*****根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應(yīng)溫度。
（2）緩沖體系
限制酶反應(yīng)的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約100mmol/L的Tris-HCl，作用是將酶反應(yīng)體系的pH維持在7.5-8.5；約10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護(hù)還原性基團(tuán)；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強(qiáng)度。由于認(rèn)識(shí)的局限性，早期的限制酶反應(yīng)體系僅根據(jù)其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得最適反應(yīng)條件?，F(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮最大的作用。
緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時(shí)以1/10的比例加入，當(dāng)然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。
(3) 反應(yīng)體積與時(shí)間
酶反應(yīng)體積一般不宜小于20ul。因?yàn)檫^(guò)小的反應(yīng)體積在加入各種成分時(shí)易產(chǎn)生誤差，甘油含量易超過(guò)10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應(yīng)體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時(shí)還要考慮反應(yīng)完畢進(jìn)行電泳時(shí)，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。
常規(guī)的酶切反應(yīng)一般控制在60min內(nèi)進(jìn)行，但也可以根據(jù)切割對(duì)象與所用的酶將保溫時(shí)間延長(zhǎng)至十幾個(gè)小時(shí)。
(4) DNA的純度與濃度
除了上述酶反應(yīng)條件外，影響酶切效果的最主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質(zhì)時(shí)會(huì)因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結(jié)合在DNA時(shí)也會(huì)影響酶切效果。。至于抽提過(guò)程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。
DNA純度的另一個(gè)指標(biāo)是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結(jié)果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術(shù)語(yǔ)稱(chēng)Smear）時(shí)，可肯定系統(tǒng)中已經(jīng)污染了DNA酶。
DNA樣品中含有大量RNA時(shí)可用RNA酶處理；含有結(jié)合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時(shí)都可用氯仿/異戊醇抽提；當(dāng)樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質(zhì)時(shí)可以通過(guò)沉淀更換一個(gè)新的緩沖體系。當(dāng)然，酶切失敗時(shí)也不能排除除DNA外的一切因素，如無(wú)菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內(nèi)切酶自身的酶活性情況。
除純度外，DNA的濃度也會(huì)影響酶切效果，一般DNA質(zhì)量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質(zhì)量濃度高達(dá)1.5ug/20ul時(shí)就可能發(fā)生酶切困難。
(5)終止酶切反應(yīng)的方法
如果需對(duì)酶切片段進(jìn)行連接或標(biāo)記等操作時(shí)，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：第一種是向反應(yīng)緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡(luò)合掉酶反應(yīng)中所需的鎂離子。但這種方法會(huì)影響需鎂離子的后續(xù)反應(yīng)。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來(lái)更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會(huì)造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫30min方能達(dá)到目的；極端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單并且未向體系中引入任何物質(zhì)，特別適用于連續(xù)進(jìn)行幾個(gè)酶切反應(yīng)；熱失活法的另一個(gè)特點(diǎn)是不用更換體系，所以不會(huì)造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。這種方法的特點(diǎn)是處理?xiàng)l件劇烈，能使酶徹底失活（不像第一種方法中酶蛋白并未變性而只是沒(méi)有激活因子而已）。
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